海洋微生物環(huán)肽Ilamycin E抗三陰性乳腺癌的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最為常見的惡性腫瘤，在女性因癌癥致死原因中占據(jù)主導(dǎo)地位。三陰性乳腺癌(TNBC)定義為缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及人表皮生長因子受體2（HER2）基因的特殊乳腺癌亞型，占乳腺癌全部類型15-20％。TNBC具有高風(fēng)險的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)率，目前仍缺乏有效的治療措施。天然化合產(chǎn)物Ilamycin家族，來源于海洋微生物次級代謝產(chǎn)物，其細胞毒活性從來沒有被報道過。有初步研究結(jié)果顯示，化合物Il

2、amycin具有抗腫瘤活性，但仍需進一步深入研究。
　　方法：
　　1.SRB法檢測細胞存活率，反映化合物Ilamycin E，F(xiàn)對乳腺癌細胞存活的影響。
　　使用不同濃度Ilamycin E，F(xiàn)在HCC1806，HCC1937，MDA-MB-468，MDA-MB-231，T47D，MCF7，SKBR3，BT474，MCF10A細胞系驗證效果，并進一步用SRB的方法測定每株細胞系準(zhǔn)確的IC50。最后根據(jù)實驗需要選出作為

3、研究的代表細胞系，作為后續(xù)實驗的材料。
　　2.EdU檢測細胞增殖
　　為了檢測Ilamycin E對細胞增殖的影響，以不同濃度Ilamycin E（0，10，20，30μM）處理HCC1937和MDA-MB-468細胞24小時，以EPI（0.2μM）作為陽性對照，然后用Click-iT EdU試劑盒進行處理，最后封片拍照，所得結(jié)果用ImageJ和IPP軟件處理，從每個處理結(jié)果中選擇3張圖片進行統(tǒng)計、處理，所得比值作為最后結(jié)

4、果。
　　3.細胞周期試驗
　　為了進一步分析Ilamycin E導(dǎo)致細胞存活抑制的主要方式，使用流式細胞儀檢測化合物對細胞周期進程的影響。用Ilamycin E不同濃度（0，10，20，30μM）處理HCC1937，MDA-MB-468細胞24小時，胰酶消化，75％乙醇4℃固定。最后以大約1×106個細胞用100μl0.6％NP40+1μl PI+1μl RNase的比例配成體系，重懸細胞。染色處理，Accuri C6(B

5、D)上機分析細胞周期，軟件FlowJo分析統(tǒng)計結(jié)果。
　　4.細胞凋亡分析
　　為了檢測化合物Ilamycin E對細胞凋亡的影響，使用AnnexinⅤ和PI雙染流式細胞方法檢測化合物Ilamycin E對細胞凋亡的影響。使用Ilamycin E不同濃度(0，10，20，30μM)處理HCC1937細胞24小時，處理MDA-MB-468細胞36小時，AnnexinⅤ和PI雙染流式細胞儀上機檢測、分析細胞凋亡情況。
　　

6、5.蛋白印跡檢測周期和凋亡相關(guān)蛋白的改變，用以探索凋亡機制
　　為了探討細胞周期和凋亡改變的機制，做了大量蛋白篩查，使用不同濃度Ilamycin E（0，10，20，30μM）處理48小時或用30μM單濃度處理HCC1937，MDA-MB-468細胞不同時間，加細胞裂解液冰上裂解30min，離心，蛋白定量，然后加4×SDS Loading Buffer，98℃5min煮樣變性，上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育

7、14小時，二抗孵育2小時，曝光儀檢測檢測各個目標(biāo)條帶變化情況。使用Photoshop作圖軟件進行數(shù)據(jù)處理。
　　6.數(shù)據(jù)處理
　　為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，實驗數(shù)據(jù)進行至少三次獨立重復(fù)的驗證。使用軟件SPSS運算t檢驗進行顯著性分析，P值＜0.05則認為有顯著性差異。流式結(jié)果使用FlowJo處理，柱形圖和線形圖使用GraphPad制作。Edu結(jié)果使用ImageJ，IPP進行重疊計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.SRB細胞存

8、活率檢測結(jié)果顯示，化合物Ilamycin E對HCC1806，HCC1937，MDA-MB-468,MDA-MB-231,T47D,MCF7,SKBR3,BT474,MCF10A細胞具有廣泛的細胞毒活性，同時化合物Ilamycin F不具有或在所給有效劑量范圍內(nèi)不具有細胞毒活性?；衔颕C50檢測結(jié)果顯示，Ilamycin E對細胞有效IC50分布為14.24-49.19μM，三陰性乳腺癌細胞HCC1937細胞系最為敏感，而人永生化乳腺

9、上皮細胞MCF10A細胞系敏感性最差?；衔颕lamycin E與F的結(jié)果差異表明Ilamycin家族化合物細胞毒活性具有特定的化學(xué)基團，這為化合物的改造指明了方向。
　　2.EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示，化合物Ilamycin E顯著抑制三陰性乳腺癌細胞系HCC1937和MDA-MB-468的DNA合成，減少細胞分裂，證明細胞增殖受到抑制。因此，初步得出結(jié)論，即化合物Ilamycin E導(dǎo)致的細胞存活抑制部分歸功于細胞增殖抑制。<

10、br>　　3.流式細胞周期檢測結(jié)果顯示，隨著化合物Ilamycin E有效作用濃度的遞增，Ilamycin E顯著增加HCC1937和MDA-MB-468兩株三陰性乳腺癌細胞G0/G1期細胞比例，并降低細胞S期和G2/M期細胞比例，化合物Ilamycin E有效抑制HCC1937和MDA-MB-468細胞G1/S進程。
　　4.流式細胞凋亡實驗結(jié)果顯示，化合物Ilamycin E明顯導(dǎo)致HCC1937和MDA-MB-468兩株三陰

11、性乳腺癌細胞凋亡比例增加，并且隨著化合物IlamycinE有效作用濃度的增加，細胞凋亡比例逐漸增加。實驗結(jié)果表明，化合物IlamycinE導(dǎo)致的細胞存活抑制部分原因歸功于誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　5.使用蛋白印跡實驗經(jīng)過大量篩查表明，Ilamycin E明顯導(dǎo)致三陰性乳腺癌細胞系HCC1937和MDA-MB-468一系列周期、凋亡相關(guān)蛋白的變化。同時，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，化合物Ilamycin E下調(diào)KLF5以及上調(diào)

12、EGR1的轉(zhuǎn)錄。而ERStress信號通路相關(guān)蛋白Bip，IRE1α，XIAP,CHOP均有顯著增加。實驗結(jié)果表明，化合物IlamycinE在調(diào)控細胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達的同時，顯著誘導(dǎo)細胞ER Stress信號通路的活化。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果顯示，Ilamycin家族成員Ilamycin E具有潛在的抗三陰性乳腺癌活性?；衔颕lamycin E導(dǎo)致三陰性乳腺癌HCC1937和MDA-MB-468細胞周期相關(guān)蛋白

13、Cyclin D1顯著下降，而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21、p27顯著上升，并引起細胞G1/S期細胞周期進程阻滯?；衔颕lamycin E還能有效誘導(dǎo)HCC1937和MDA-MB-468細胞ERstress的產(chǎn)生，并導(dǎo)致細胞凋亡。實驗還發(fā)現(xiàn)化合物Ilamycin E能有效抑制KLF5轉(zhuǎn)錄，同時上調(diào)腫瘤抑制因子EGR1的表達。綜合結(jié)果表明化合物Ilamycin E能有效抑制三陰性乳腺癌，這或許將為三陰性乳腺癌的治療提供更多的可能。