小鼠心肌細(xì)胞肌鈣蛋白I基因的DNA甲基化調(diào)控.pdf

1、目的：在心臟發(fā)育過(guò)程中，TnI基因呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)過(guò)程，但其調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。本研究以小鼠為研究對(duì)象，探討TnI基因時(shí)序性表達(dá)過(guò)程中DNA甲基化的調(diào)控作用。
　　方法：應(yīng)用DNA甲基化特異性PCR（MSP）和亞硫酸鹽測(cè)序（BSP）技術(shù)分別檢測(cè)胚胎14.5、17.5天（E14.5、E17.5），新生1天（NB），生后7天、14天（P7、P14）及成年小鼠心臟中ssTnI和cTnI啟動(dòng)子區(qū)域CpG島及CpG位點(diǎn)甲基化水平。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄P

2、CR（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫沉淀（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)上述6個(gè)時(shí)間點(diǎn)中小鼠心臟ssTnI及cTnImRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示NB、P7、P14、成年組ssTnImRNA表達(dá)量分別為：0.939±0.048、0.661±0.121、0.070±0.022、0.003±0.001，較E17.5（1.251±0.054）明顯降低（P＜0.05），呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)；而P14

3、、成年組cTnImRNA表達(dá)量分別為：1.415±0.223、2.959±0.192較P7（0.825±0.095）明顯升高（P＜0.05），呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示E17.5、NB、P7、P14、P21組ssTnI蛋白質(zhì)表達(dá)分別占TnI總量的90％、60%、45%、35%、0%（P＜0.05），呈逐漸降低的趨勢(shì)；cTnI蛋白在E17.5、NB、P7、P14、P21組分別占TnI總量的10%、4

4、0%、55%、65%、100%（P＜0.05），呈逐漸升高的趨勢(shì)。
　　3.甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果顯示ssTnICpG位點(diǎn)在E14.5、E17.5、NB組中M引物無(wú)條帶，U引物出現(xiàn)擴(kuò)增條帶；P7、P14組中M引物、U引物均存在擴(kuò)增條帶；成年組中僅有M引物出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，U引物無(wú)條帶；而ssTnI、cTnICpG島以及cTnICpG位點(diǎn)在上述六個(gè)時(shí)間點(diǎn)中僅M引物出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，U引物無(wú)條帶。
　　4.亞硫酸鹽測(cè)序（BSP

5、）結(jié)果顯示ssTnICpG位點(diǎn)甲基化率在E14.5、E17.5、NB組中均為0%，在P7、P14、成年組分別為20%、50%、80%（P＜0.05），呈逐漸升高的趨勢(shì)；而ssTnI、cTnICpG島以及cTnICpG位點(diǎn)在此6個(gè)時(shí)間點(diǎn)中甲基化率分別為100%、90%、67%。
　　結(jié)論：
　　1.小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中ssTnI基因mRNA及蛋白表達(dá)水平在出生后逐漸降低，而cTnI基因mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸增高，兩者存在時(shí)序