重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)條件優(yōu)化及其催化合成右旋糖酐的研究.pdf

1、右旋糖酐蔗糖酶(EC.2.4.1.5)能以蔗糖為底物，將D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移到正在增長的葡聚糖鏈上形成高分子的葡萄糖聚合物右旋糖酐。右旋糖酐在醫(yī)藥、化工、食品工業(yè)中都有重要的用途。工業(yè)生產(chǎn)右旋糖酐是發(fā)酵腸膜狀明串珠菌，通過加入蔗糖誘導(dǎo)產(chǎn)生右旋糖酐蔗糖酶。因?yàn)樵谠曛蟹蛛x該酶比較困難不利于研究該酶的催化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)將右旋糖酐基因克隆到大腸桿菌中并表達(dá)。 本研究分別以IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和乳糖為誘導(dǎo)物，通過設(shè)計(jì)正交

2、實(shí)驗(yàn)，考察培養(yǎng)基中各成分及其濃度對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果的影響，成功選擇了適合不同誘導(dǎo)物可高效表達(dá)該酶的兩種表達(dá)培養(yǎng)基。在選擇了合適的培養(yǎng)基之后，分別研究誘導(dǎo)條件的影響。用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，其最佳條件為37℃菌濃達(dá)到2.0時(shí)，加入IPTG至0.25mmol/L繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。用乳糖誘導(dǎo)時(shí)，其最佳條件為菌濃3.0，加入乳糖至1.0％繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。從結(jié)果來看，乳糖誘導(dǎo)效果不及IPTG的五分之一，但是對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)乳糖誘導(dǎo)的低價(jià)和無毒則更有價(jià)值。

3、 工程菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后生產(chǎn)含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶，通過硫酸銨沉淀、Ni-NTA親和層析純化，得到純度較高的酶蛋白，并對(duì)純酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)研究。經(jīng)過SDS-PAGE測得該酶的分子量約為170 kDa，與理論推測值基本相同。以蔗糖為底物，酶促反應(yīng)的最適溫度為25～30℃，最適pH值為5.4，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為10.43 mmol/L；酶活在pH5.0～8.0較為穩(wěn)定，在室溫(25℃)保藏4天仍有59％的酶活

4、力，4℃保存7周酶活力僅下降一半，但在35℃以上失活很快；0.5mol/L Ca2+對(duì)催化作用有較大的促進(jìn)，1.0mmol/L Mg2+有微弱的促進(jìn)作用，Cu2+和SDS的抑制作用最強(qiáng)。 研究利用表達(dá)的重組右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖為底物合成右旋糖酐，探討溫度、蔗糖濃度和pH值對(duì)合成糖酐的影響。結(jié)果表明，底物轉(zhuǎn)化率超過80％，合成的糖酐多為大分子但溶解性很好。蔗糖濃度對(duì)右旋糖酐產(chǎn)率的影響最大，其次是溫度，影響最小的是pH值。研究對(duì)該酶