hβ2亞基在BK通道孔中的作用位點(diǎn)探測(cè)及TRPV1通道的脫敏機(jī)制研究.pdf

1、現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展改變著人們對(duì)生命獲得過(guò)程的認(rèn)識(shí)，而離子通道的研究不僅與信號(hào)發(fā)生、傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)緊密關(guān)聯(lián)，同時(shí)也涉及到誘發(fā)各種遺傳或非遺傳疾病的分子機(jī)制。了解離子通道的精細(xì)結(jié)構(gòu)，探討離子通道的門(mén)控機(jī)制和動(dòng)力學(xué)特性，弄清楚離子通道結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系意義重大。本研究工作由兩部分組成：第一部分探討了鈣和電壓激活的大電導(dǎo)鉀離子通道（Maxik 通道，又名BK 通道）的β2 亞基N 端失活域在由α亞基組成的孔道中的作用位點(diǎn)；文章第二部分則是講述痛覺(jué)

2、敏感型通道TRPV1的適應(yīng)性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的。
　　 BK 通道廣泛地存在于可興奮細(xì)胞，特別是神經(jīng)系統(tǒng)中，具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣濃度和膜電位等重要生理功能。目前，電壓依賴(lài)型鉀離子通道（Kv 通道）的研究已取得較大進(jìn)展。BK通道與Kv通道在結(jié)構(gòu)和功能上既存在某些相似之處又各具特點(diǎn)。如它們都結(jié)合有β輔助亞基，并由β亞基的N端疏水性氨基酸殘基堵塞孔道引起N型失活。
　　 然而現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，K+通道的孔道阻斷劑（如TEA、QX-31

3、4等）能夠減慢Kv通道的失活過(guò)程，然而卻不能減慢BK 通道的失活。為什么這兩者如此不同？BK通道的β2亞基N端失活域是否進(jìn)入由α亞基組成的BK孔道？?jī)烧呔烤拱l(fā)生了怎樣的相互作用？通道阻斷劑為什么不和失活域在通道孔中相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)？本課題的研究目的之一即是要回答和解決這些目前仍然困擾我們的問(wèn)題。我們將hβ2N端的前三個(gè)氨基酸FIW突變?yōu)镕WI，發(fā)現(xiàn)hβ2的這一突變體hβ2-FWI對(duì)BK通道的失活沒(méi)有影響，但通道的失活恢復(fù)曲線(xiàn)卻由單指數(shù)轉(zhuǎn)

4、變?yōu)殡p指數(shù)。利用hβ2-FWI所引起的雙指數(shù)恢復(fù)特性變化作為兩者間相互作用的判定依據(jù)。通過(guò)丙氨酸掃描法(Alaninescanning)，即將α亞基形成孔道的S6區(qū)疏水性氨基酸依次突變?yōu)槭杷暂^弱的丙氨酸，然后通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄分析失活后通道的恢復(fù)特性變化，進(jìn)而了解兩者間的相互作用。
　　 借助作為通道孔道阻滯劑的麻醉劑QX-314和TEA等藥物進(jìn)一步解釋了BK通道失活的非競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。我們得到了如下幾個(gè)結(jié)論：
　　 (1)

5、位于mSlo1孔道中的氨基酸Ile-323是失活過(guò)程中與β2亞基N端失活域有相互作用的主要位點(diǎn)。孔道內(nèi)的另外兩個(gè)氨基酸M314和V319 也參與了這一過(guò)程。
　　 根據(jù)hβ2-FWI 亞基N 末端的線(xiàn)性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，我們推測(cè)mSlo1孔道與hβ2-FWI在BK通道失活過(guò)程中存在如下的相互作用關(guān)系：I323-I，V319-W，M314-F，其中I323起著主導(dǎo)性的作用。同時(shí)進(jìn)一步明確了β2亞基的失活域的確進(jìn)入了BK通道的孔道從而引起通

6、道的失活。
　　 (2)通道阻滯劑QX-314和TEA在BK孔道內(nèi)均無(wú)特異性的結(jié)合位點(diǎn)。因此它們不會(huì)像其它胞內(nèi)阻斷劑那樣在抑制Kv 通道電流的同時(shí)還減慢通道的失活，這是因?yàn)棣? N 端失活域的作用位置比較靠近孔道口，即孔道內(nèi)的最后一個(gè)疏水性氨基酸Ile-323，而QX-314的作用位置位于孔道內(nèi)，因此QX-314不會(huì)與失活域競(jìng)爭(zhēng)相同的作用位點(diǎn)，從而不會(huì)影響β2 引起的通道失活過(guò)程。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出了一個(gè)全新的非競(jìng)爭(zhēng)模型，該

7、模型不僅可以很好的解釋我們的數(shù)據(jù)，而且為進(jìn)一步闡釋BK通道的結(jié)構(gòu)和門(mén)控機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)和理論支持。
　　 (3)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：與野生型mslo1 通道電流相比，突變型I323A不管是單通道還是宏觀電流均有明顯差異，表現(xiàn)為出現(xiàn)了野生型通道所不具有的外向整流特性。形式上突變型I323A的單通道出現(xiàn)了非常像噪聲的電流，同一電壓下可以同時(shí)記錄得到幾個(gè)不同大小的單通道電流，即是說(shuō)Ile-323A 還引起了BK 通道電導(dǎo)的改變。

8、據(jù)此我們推測(cè)Ile-323對(duì)BK 通道具有雙重作用，既是β2 失活域在孔道中的作用位點(diǎn)，同時(shí)還能調(diào)節(jié)BK 通道的門(mén)控特性。另外還發(fā)現(xiàn)一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，312位點(diǎn)的Leu 亮氨酸殘基的突變能夠極大地改變BK 通道的電壓依賴(lài)性。我們研究小組在后續(xù)的兩篇文章中分別證明了這兩點(diǎn)推測(cè)：Ile-323 確實(shí)為BK 通道的關(guān)節(jié)所在，323 點(diǎn)的氨基酸殘基疏水性降低，會(huì)使得“關(guān)節(jié)”變得松弛，進(jìn)而導(dǎo)致通道開(kāi)放時(shí)四個(gè)亞基間協(xié)同性的不一致和開(kāi)放幾率的改變(

9、Guo et al，Biophys J. 2008 May 1;
　　 94(9):3714-25)。而Leu312位點(diǎn)則可以極大地增強(qiáng)BK 通道的電壓敏感性（Wu et al.,J Biol Chem. 2009 Aug 28；284(35):23353-63）。
　　 適應(yīng)性調(diào)節(jié)是大部分感覺(jué)器官共有的一種性質(zhì)，但是痛覺(jué)適應(yīng)性產(chǎn)生的根源和機(jī)理仍然不為人們所知。文章的第二部分在受體水平探討了傷害感受器TRPV1 通道的適

10、應(yīng)性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)通道在脫敏反應(yīng)發(fā)生后，僅改變了通道對(duì)激動(dòng)劑的敏感性，而不影響最大電流的響應(yīng)，據(jù)此，我們?cè)诿撁舾心畹幕A(chǔ)上提出了痛覺(jué)適應(yīng)性調(diào)節(jié)概念。該部分我們主要得到以下幾個(gè)主要結(jié)論：
　　 (1)Ca2+經(jīng)由開(kāi)放的TRPV1 通道內(nèi)流引起脫敏反應(yīng)的發(fā)生，脫敏反應(yīng)發(fā)生后僅改變了通道對(duì)辣椒素的敏感性，濃度敏感性降低了14 倍，但這一改變并不影響通道的功能。
　　 (2)通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)和膜片鉗記錄

11、技術(shù)，我們證實(shí)了PIP2參與了TRPV1 通道脫敏反應(yīng)的發(fā)生，PIP2 分解的速率和量的變化都足以改變通道對(duì)激動(dòng)劑的響應(yīng)。借助藥物Rapamycin 專(zhuān)一性降低細(xì)胞內(nèi)PIP2含量作為研究工具，通過(guò)測(cè)量通道對(duì)辣椒素濃度依賴(lài)性曲線(xiàn)，我們進(jìn)一步量化了PIP2對(duì)脫敏反應(yīng)的貢獻(xiàn)，約占60%。
　　 (3)我們還發(fā)現(xiàn)TRPV1 通道對(duì)激動(dòng)劑敏感性的改變依賴(lài)于刺激強(qiáng)度，不同的刺激強(qiáng)度得到不同程度的脫敏響應(yīng)。我們推測(cè)有兩種可能性：一是通道蛋白有