雌核發(fā)育二倍體鯽鯉克隆體系的建立及其衍生后代生物學(xué)特性的研究.pdf

1、通過(guò)紅鯽(Carassius auratus red var.，♀)與鯉魚(yú)(Cyprinus carpioL.，♂)遠(yuǎn)緣雜培育出兩性可育的異源四倍體鯽鯉群體(AT)。AT能穩(wěn)定產(chǎn)生二倍體精子和卵子，對(duì)其產(chǎn)生的二倍體卵子進(jìn)行雌核發(fā)育研究，建立了一個(gè)能穩(wěn)定產(chǎn)生二倍體卵子的雌核發(fā)育二倍體鯽鯉克隆體系(G1～G5)。利用雌核發(fā)育二倍體鯽鯉克隆體系產(chǎn)生的二倍體卵子與四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體精子雜交獲得了改良四倍體鯽鯉G×AT。重要的是，在改良四倍體

2、鯽鯉群體(G1×AT)中選育出2％的高背型個(gè)體。高背型G1×AT自交，后代分化形成3種二倍體魚(yú)：高背型紅鯽、高背型雙尾金魚(yú)和高背型青灰色鯉魚(yú)。本文主要研究?jī)?nèi)容包括：①雌核發(fā)育二倍體鯽鯉克隆體系的建立及其遺傳機(jī)制研究；②對(duì)人工雙尾金魚(yú)的細(xì)胞和分子生物學(xué)特性進(jìn)行深入分析，來(lái)探討金魚(yú)的起源與進(jìn)化問(wèn)題；③高背型鯽魚(yú)和高背型青灰色鯉魚(yú)的生物學(xué)特征及其應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴在已獲得雌核發(fā)育二倍體鯽鯉第三代G3的基礎(chǔ)上，制備出G4

3、和G5。建立了一個(gè)能穩(wěn)定產(chǎn)生二倍體卵子的雌核發(fā)育二倍體鯽鯉克隆體系(G1～G5)。為進(jìn)一步研究二倍體魚(yú)產(chǎn)生二倍體卵子的機(jī)制，我們對(duì)G5早期性腺進(jìn)行體外組織培育。在早期性腺生長(zhǎng)增殖中，發(fā)現(xiàn)大量生殖細(xì)胞發(fā)生融合的現(xiàn)象。而在對(duì)照組早期草魚(yú)和鯉魚(yú)性腺的體外培育中，至今未發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞融合的現(xiàn)象。這對(duì)揭示二倍體雜交魚(yú)產(chǎn)生二倍體配子的機(jī)制具有重要的價(jià)值。
　　 ⑵對(duì)高背型人工雙尾金魚(yú)(AG)的外形及細(xì)胞生物學(xué)特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明，AG與普通

4、金魚(yú)(NG)的可量性狀和可數(shù)性狀基本一致；AG與原始母本RCC的一些外形特征更為相似，而與原始父本CC的外形特征差異較大。從外形特征上可以初步判斷金魚(yú)與鯽魚(yú)的親緣關(guān)系比較近。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明AG是一種二倍體魚(yú)。染色體檢測(cè)表明AG染色體數(shù)為2n=100，染色體核型公式為22m+34sm+22st+22t。通過(guò)對(duì)AG性腺的顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)它們具有正常的精巢和卵巢結(jié)構(gòu)，兩性個(gè)體一年性成熟，分別能產(chǎn)生成熟的單倍體精子和卵子。<

5、br>　　 ⑶在AG分子遺傳特性研究中，首先對(duì)NG、AG、RCC和CC的Sox基因進(jìn)行檢測(cè)。AG與RCC的Sox基因擴(kuò)增條帶一致，同為～200、～600和～1900bp的擴(kuò)增帶，而在NG中只存在～200和～600bp的條帶，CC中只存在～200和～900bp的擴(kuò)增帶。另外，對(duì)這四種魚(yú)的5S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明NG與AG具有相同的擴(kuò)增帶，它們以具有獨(dú)特的168bp條帶而異于RCC和CC。同時(shí)在對(duì)5S rDNA進(jìn)行染色體定位

6、研究中，發(fā)現(xiàn)NG、AG和RCC的原位雜交結(jié)果一致，它們都具有兩個(gè)較強(qiáng)的雜交信號(hào)，而在CC染色體中沒(méi)有檢測(cè)到相關(guān)信號(hào)。對(duì)AG線粒體DNA全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序。AG粒體基因組全序列長(zhǎng)為16579bp，其結(jié)構(gòu)和基因排列與其他鯉科魚(yú)一致。對(duì)線粒體全序列進(jìn)行比對(duì)，AG與原始親本RCC和CC的相似比分別為99.5％和89.4％，符合線粒體母性遺傳規(guī)律；AG與NG的相似比高達(dá)99.4％，表明兩者可能具有相同的起源。從鯉魚(yú)和鳙魚(yú)的微衛(wèi)星引物中篩選出7對(duì)引物對(duì)N

7、G、AG、RCC和CC群體進(jìn)行微衛(wèi)星檢測(cè)。結(jié)果表明，在AG群體中各等位基因數(shù)為1～8個(gè)，大小在140～300bp，群體呈現(xiàn)了高度的遺傳多態(tài)性，遺傳異質(zhì)性較大，表明基因組來(lái)源復(fù)雜，基因高度雜合。
　　 ⑷對(duì)高背型鯽魚(yú)相關(guān)生物學(xué)特征進(jìn)行研究，結(jié)果表明它們是一種二倍體魚(yú)，兩性可育，一年性成熟；它們?cè)谕庑紊暇哂畜w背高、尾柄短、頭部小的優(yōu)良特性。用雌性高背型鯽魚(yú)與雄性改良四倍體鯽鯉交配，獲得了改良三倍體鯽魚(yú)。這種改良三倍體鯽魚(yú)不僅在外形上

8、繼承了母本高背特征，而且具有生長(zhǎng)速度快、不育、營(yíng)養(yǎng)成分含量高等特征。
　　 ⑸對(duì)高背型青灰色鯉魚(yú)(ICC)及其自交后代的外形、倍性、性腺發(fā)育以及Sox基因進(jìn)行研究。結(jié)果表明ICC與普通鯉魚(yú)(CC)相比，ICC在外形上具有顯著的高背特征。ICC是一種二倍體魚(yú)，兩性可育，一年性成熟。值得注意的是Sox基因檢測(cè)結(jié)果表明ICC是一種雜交個(gè)體，具有與AT一致的擴(kuò)增帶(～200、～600、～900和～1900bp)，而CC為～200和～90