Notch配體DLL4在手足口病患兒中表達、臨床意義和功能分析.pdf

1、手足口病是一種危及全世界兒童健康的急性傳染病。在中國，每年至少數(shù)百萬兒童感染手足口病，并有數(shù)百例危重癥病例死亡。手足口病可由EV71（腸道病毒71）和CVA16（柯薩奇病毒A16）等病毒感染所致，伴有顯著的免疫紊亂，表現(xiàn)為炎癥T細(xì)胞的異常增殖和分化所導(dǎo)致的異常的炎癥因子分泌。Notch信號通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種生理、病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)Notch信號可通過細(xì)胞因子非依賴途徑調(diào)控T淋巴細(xì)胞分化。我們希望通過

2、本次研究，闡明Notch信號通路在手足口病發(fā)病中的可能機制，為開發(fā)手足口病有效預(yù)防和治療策略提供重要理論依據(jù)。
　　第一部分、Notch配體DLL4在手足口病患兒中表達和臨床意義
　　目的：了解Notch信號通路在手足口病發(fā)病中的作用。
　　方法：2012年6月～2012年12月蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染病房和兒科重癥監(jiān)護病房收住的82例手足口病患兒，設(shè)為手足口病組，根據(jù)其臨床表現(xiàn)和實驗室結(jié)果分為單純組和腦炎組，對照組為

3、外科腹股溝斜疝擇期手術(shù)患兒40例，將其流行病學(xué)、臨床理化特征、外周血免疫細(xì)胞水平和Notch配體水平進行分析比較。
　　結(jié)果：
　　1.手足口病組外周血單個核細(xì)胞中Notch配體DLL1和DLL4的mRNA表達水平顯著高于對照組（P<0.05），而Jagged1和Jagged2的表達在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，四種配體在手足口病單純組和腦炎組之間表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)測定手足口病組外周血中樹突狀細(xì)

4、胞(DCs)表面 DLL4表達水平顯著高于對照組（P<0.05），健康志愿者外周血DCs表面不表達DLL4。
　　3.手足口病組外周血CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞和CD3+CD8+細(xì)胞水平顯著低于對照組，CD3-CD19+細(xì)胞水平顯著高于對照組（P<0.05），手足口病單純組CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞水平顯著高于腦炎組，CD3-CD19+細(xì)胞水平顯著低于腦炎組（P<0.05），而CD3+CD8+和CD3-CD16+C

5、D56+細(xì)胞水平兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.手足口病組外周血單個核細(xì)胞中DLL4的RNA表達水平和CD3+淋巴細(xì)胞表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.23，P=0.00），與 CD3+CD8+淋巴細(xì)胞表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.23，P=0.02），與 CD3-CD19+淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.36，P=0.00），而DLL4表達與CD3+CD4+細(xì)胞和CD3-CD16+56+細(xì)胞無顯著相關(guān)。
　　5.手足口病組外周血單個核細(xì)胞中DL

6、L4的RNA表達水平與腦脊液中WBC總數(shù)呈正相關(guān)（r=0.45，P=0.01），與腦脊液總蛋白含量（S-TP）呈正相關(guān)（r=0.37，P=0.01）（見圖2）。
　　結(jié)論：Notch信號通路可能參與手足口病的發(fā)??；Notch配體 DLL4與外周血CD3+，CD3+CD8+和CD3-CD19+淋巴細(xì)胞有較強的相關(guān)性，可能通過影響這些免疫細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)從而影響疾病的預(yù)后，另DLL4與腦脊液中WBC和總蛋白水平顯著相關(guān)，可能成為判斷手

7、足口病并發(fā)腦炎的一個指標(biāo)。
　　第二部分、人DLL4+DCs對CD4+T細(xì)胞向Th1及Th17分化的調(diào)控
　　目的：了解體外炎癥環(huán)境下DLL4+DCs能否調(diào)控CD4+T細(xì)胞向Th1及Th17分化。
　　方法：體外采用不同的Toll樣受體激動劑刺激從健康志愿者外周血分離獲得的
　　PBMCs來模擬體內(nèi)的炎癥環(huán)境，測定刺激后樹突狀細(xì)胞（DCs）表達 DLL4水平和DCs活化狀態(tài)。
　　分離純化健康志愿者外周血D

8、Cs經(jīng)過R848刺激獲得DLL4+DCs，與來自不同志愿者的純化后的CD4+T淋巴細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)IFN-a和IL-17等細(xì)胞因子表達水平，分析DLL4+DCs對CD4+T淋巴細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　1.健康志愿者外周血單個核細(xì)胞經(jīng)過不同Toll受體激動劑Pam3CSK4、LPS和R848刺激24h，均能誘導(dǎo)DCs表達DLL4（18.2％～24.7%）。
　　2.R8

9、48刺激顯著上調(diào)了DCs表面HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86的表達水平；R848可以誘導(dǎo)DCs表達IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA顯著增加。
　　3.經(jīng)過R848刺激的DCs和CD4+T細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)7天，相對于對照組，觀察組誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞表達包括更多IFN-γ和IL-17，提前加入DLL4+特異性中和抗體能夠降低IFN-γ和IL-17的水平。
　　結(jié)論：體外