豬白血病抑制因子（LIF）的分子生物學(xué)研究——豬LIF的cDNA克隆，原核、真核表達(dá)，特性，免疫定位.pdf

1、LIF(白血病抑制因子)是一種多功能的細(xì)胞因子，屬于白介素-6(IL-6)家族中成員，與IL-11、OSM(onconstatin-M)、CNTF(ciliaryneurotrophicfactor)和CT-1(cardiotrophin)共享gp130受體亞基。LIF的天然形式是38-67kDa的糖基化蛋白，在哺乳動(dòng)物的成年個(gè)體和胚胎中廣泛表達(dá)。體內(nèi)外研究表明，LIF具有多種生物功能，包括誘導(dǎo)骨髓白細(xì)胞分化，促進(jìn)原始生殖細(xì)胞的增殖，維

2、持胚胎干細(xì)胞的多潛能性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化及胚泡著床、海馬-垂體-腎上腺素軸的活化及垂體發(fā)育等。 LIF在體外能夠抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的分化，維持干細(xì)胞處于多潛能狀態(tài)。這種能力導(dǎo)致一種新的生物技術(shù)——基因打靶的誕生，從而使得人們?cè)谂咛ジ杉?xì)胞水平上進(jìn)行基因的改造和敲出成為可能，并且通過(guò)胚胎操作可獲得能穩(wěn)定遺傳的突變小鼠個(gè)體，從而能夠在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因功能的研究。然而這種操作除了小鼠之外，其他動(dòng)物至今沒(méi)有獲得將新的遺傳性狀轉(zhuǎn)進(jìn)生殖系

3、的嵌合個(gè)體。究其原因有多種，其中之一可能是采用小鼠LIF和鼠源的滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。盡管LIF蛋白及其基因在哺乳動(dòng)物之間是高度保守的，其對(duì)不同種系胚胎干細(xì)胞的作用仍可能存在差別。 豬的許多器官在形態(tài)和生理方面與人相似，因此是研究人體生理和人類(lèi)疾病比較理想的模式動(dòng)物。然而，穩(wěn)定的多潛能豬胚胎干細(xì)胞系至今沒(méi)有培養(yǎng)成功。沒(méi)有使用豬LIF可能是其中的原因之一。因此我們推測(cè)豬LIF在培養(yǎng)豬ES或EG細(xì)胞方面可能比其它物種的LIF

4、更有效，值得探索應(yīng)用重組豬LIF協(xié)助培養(yǎng)穩(wěn)定的多潛能豬胚胎干細(xì)胞。但是，編碼豬LIF的cDNA基因序列還沒(méi)有克隆。本文的研究目的是克隆和表達(dá)豬LIF基因，獲得有活性的重組豬LIF蛋白，為進(jìn)一步培養(yǎng)豬胚胎干細(xì)胞做好準(zhǔn)備。 在本研究中，我們采用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)克隆了豬LIF的cDNA序列，并進(jìn)行了原核、真核表達(dá)以及功能研究。首先，采用異硫氰酸胍法從仔豬脾臟中提取總RNA，然后提取mRNA并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到60

5、6bp編碼全長(zhǎng)豬LIF蛋白(202個(gè)氨基酸)和567bp編碼成熟豬LIF蛋白(189個(gè)氨基酸)的cDNA序列。通過(guò)序列比對(duì)，豬全長(zhǎng)LIF蛋白與人LIF有86％的同源性，而與小鼠LIF有84％的同源性，三者之間6個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)和6個(gè)能形成二硫鍵的半胱氨酸完全保守。獲得的606bp全長(zhǎng)豬LIF編碼序列(pLIF)亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-HisA，使表達(dá)的pLIF蛋白C-末端帶有c-myc和6His標(biāo)簽，可用c-m

6、yc或6His標(biāo)簽抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行檢測(cè)；將567bp的成熟豬LIF編碼序列(pmLIF)克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET31b中，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-pLIF-MycHis和pET31b-pmLIF。同時(shí)以pcDNA3.1-pLIF-MycHis為模板擴(kuò)增出帶c-myc和His6編碼序列的基因片斷，構(gòu)建出另外一個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒pET31b-pmLIF-MycHis。將質(zhì)粒pET31b-pmLIF和pET31b-pmLIF-MycHi

7、s轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行重組蛋白的原核表達(dá)，SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后顯示出20kDa和25kDa的目的蛋白條帶。提取包涵體后，在變性條件下采用HiTrapTMchelatingcolumn進(jìn)行親和層析并在柱上復(fù)性，獲得了有活性的重組成熟型豬LIF蛋白。用質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-HisA轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)。經(jīng)過(guò)篩選和鑒定，得到兩株能穩(wěn)定表達(dá)重組分泌型豬LIF蛋白的CHO細(xì)胞系，其表達(dá)的重組豬LIF