豬CD163和Sn的分子克隆、原核表達(dá)與免疫血清制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)以妊娠母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸道癥狀為主要特征,是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的一種病毒性傳染病。PRRSV主要感染豬的巨噬細(xì)胞,引起嚴(yán)重的免疫抑制。病毒以受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞,目前已知的受體分子有硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素(sialoadhesin,Sn)和CD163,其中硫酸乙酰肝素為非特異吸附分子,Sn介導(dǎo)

2、病毒的特異性吸附和進(jìn)入,CD163主要與病毒的細(xì)胞內(nèi)脫衣殼有關(guān)。目前PRRS主要用疫苗接種預(yù)防,但隨著病毒的不斷變異,免疫效果不佳,因此迫切需要研究防控PRRS的新策略。
　　 本研究的目的是獲得豬CD163和Sn重組抗原和免疫血清,為PRRSV受體分子的靶向RNA干涉和基因敲除等防控新策略研究提供檢測(cè)試劑。根據(jù)發(fā)表的序列設(shè)計(jì)引物,先用RT-PCR從豬巨噬細(xì)胞RNA中擴(kuò)增豬CD163和Sn cDNA片段,再用PCR擴(kuò)增親水性和抗

3、原指數(shù)較高的cDNA片段,將其克隆入質(zhì)粒載體進(jìn)行序列測(cè)定。將序列正確的cDNA片段克隆入含細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)胞外區(qū)(IgV)編碼序列的原核表達(dá)載體,用IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá),用鎳親和柱純化融合蛋白。以50μg蛋白/只的劑量3次免疫小鼠,用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。以表達(dá)CD163和Sn的豬巨噬細(xì)胞和不表達(dá)CD163和Sn的PK15細(xì)胞為抗原,用Western blotting和間接免疫熒光驗(yàn)證免疫血清的特異性。結(jié)

4、果顯示RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)期結(jié)果相符,CD163與發(fā)表序列的核苷酸序列同源性為99.5％,Sn與發(fā)表序列的核苷酸序列同源性為99.4％,氨基酸序列同源性均為100％;重組大腸桿菌表達(dá)的CTLA-4 IgV-CD163和CTLA-4 IgV-Sn融合蛋白為預(yù)期的43kDa和32Da,主要以包涵體形式存在。免疫小鼠血清的ELISA抗體效價(jià)分別為1:300000和1:40000,能在CD163+和Sn+細(xì)胞中檢測(cè)到預(yù)期的120kDa