豬Rspo3基因的原核及真核表達(dá)研究.pdf

1、Rspo基因家族是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因家族，包括4個(gè)家族成員，通過(guò)與胞膜蛋白FZD和LRP5/6相互作用而激活Wnt/β-catenin（β連環(huán)蛋白）信號(hào)途徑，對(duì)細(xì)胞增殖分化、個(gè)體發(fā)育以及腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等進(jìn)行調(diào)控。Rspo基因家族分布廣泛，在不同物種中具有很高的保守性。Rspo基因尤其是Rspo3基因，通過(guò)基因敲除手段研究其功能的時(shí)候，敲除了Rspo3基因的小鼠不能正常發(fā)育成活體，揭示了 Rspo3基因在動(dòng)物個(gè)體發(fā)育中起著極為關(guān)鍵的作用，

2、但同時(shí)為進(jìn)一步研究基因功能帶來(lái)很大的障礙。通過(guò)對(duì)豬Rspo3基因的研究，對(duì)豬的新品種選育、疾病防治等都有重大的意義。
　　本試驗(yàn)利用PCR的方法，克隆得到了豬Rspo3基因，檢測(cè)了該基因的組織表達(dá)分布，并利用pET28a作為載體成功在大腸桿菌BL21中得到表達(dá)。為了進(jìn)一步在真核細(xì)胞內(nèi)研究Rspo3基因功能，構(gòu)建了不同啟動(dòng)子組合的真核表達(dá)載體，并對(duì)不同載體的表達(dá)效率進(jìn)行了篩選。
　　1.利用電子克隆技術(shù)，設(shè)計(jì)了豬Rspo3基因

3、的擴(kuò)增引物，以豬的肝臟提取的總RNA為模板，利用RT-PCR成功獲取了豬的Rspo3基因，經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)，豬Rspo3的開(kāi)放閱讀框有828bp，編碼275個(gè)氨基酸，其中包含56個(gè)酸性氨基酸和62個(gè)堿性氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為31.32 KDa，等電點(diǎn)為：9.94，并對(duì)豬Rspo3的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，蛋白分子三維尺寸為：X：44.486 Y：45.211 Z：47.410（單位：10-10米），屬于球狀蛋白質(zhì)。Rspo3基因在豬各個(gè)組織表達(dá)

4、分布檢測(cè)表明：Rspo3基因除了在脾和脂肪組織中幾乎很少表達(dá)外，其它常見(jiàn)組織中均有表達(dá)，其中在腦和睪丸表達(dá)豐度最高；
　　2.將豬Rspo3基因整合到pET28a原核表達(dá)載體上，在Rspo3基因前添加了6×His-Tag，便于后期檢測(cè)和純化，利用大腸桿菌BL21作為宿主菌，優(yōu)化后的豬Rspo3基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)條件為：溫度26℃時(shí)，0.5mg/ml的IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間為2h。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Wester

5、n blot檢測(cè)，確認(rèn)成功表達(dá)了融合蛋白，分子量為35.19kDa；
　　3.用酶切連接技術(shù)將Rspo3基因與10個(gè)不同啟動(dòng)子組合的真核表達(dá)載體（P1-P10）進(jìn)行連接時(shí)，Rspo3自身所帶的NcoI酶切位點(diǎn)成為正常的酶切連接反應(yīng)的障礙。利用重疊延伸PCR的方法，先對(duì)豬Rspo3基因自身攜帶的NcoI酶切位點(diǎn)進(jìn)行了同義突變，測(cè)序結(jié)果證實(shí)了突變獲得了成功，除了突變位點(diǎn)，其它序列保持了不變，編碼的氨基酸序列沒(méi)有改變。利用亞克隆的方法，

6、將突變后的Rspo3基因從T載體上NcoI和NheI雙酶切后與P1-P10相連，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序均驗(yàn)證正確，成功的構(gòu)建了攜帶Rspo3基因的10個(gè)不同啟動(dòng)子組合的真核表達(dá)載體；
　　4.在PK15細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果表明，GFP蛋白表達(dá)的效率最高的P5質(zhì)粒，相對(duì)于對(duì)照組轉(zhuǎn)染peGFP-N1質(zhì)粒提高了458.9％，到第14天還能觀測(cè)到GFP熒光，P6質(zhì)粒的GFP表達(dá)效率僅次于P5質(zhì)粒。用Q-PCR檢測(cè)Rspo3效率P5質(zhì)粒和P6

7、質(zhì)粒顯著高于其它組，考慮到誤差因素和檢測(cè)目的分子的差異，最合適PK15細(xì)胞平臺(tái)的啟動(dòng)子組合是P5質(zhì)粒所攜帶的CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ CMV(Human)；
　　5.對(duì)雞成纖維細(xì)胞DF1、犬腎細(xì)胞MDCK和人源的Hela細(xì)胞，也進(jìn)行了不同啟動(dòng)子組合的篩選，對(duì)不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)、GFP熒光吸光值測(cè)定和表達(dá)持續(xù)時(shí)間測(cè)定，在DF1細(xì)胞和MDCK細(xì)胞中表達(dá)效率最高的是P6質(zhì)粒，啟動(dòng)子組合為

8、啟動(dòng)子組合為CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ Sv40(Viral)。而在Hela細(xì)胞上表達(dá)效率最高的是P5質(zhì)粒，啟動(dòng)子組合為CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ CMV(Human)。
　　綜上所述，本試驗(yàn)成功的克隆得到豬Rspo3基因，首次對(duì)該基因的不同組織表達(dá)分布進(jìn)行了檢測(cè)，在大腸桿菌BL21也成功獲得了蛋白表達(dá)。構(gòu)建了攜帶Rspo3基因不同啟動(dòng)子組合的真核表達(dá)載體，并對(duì)不同啟