豬Rspo3基因的原核及真核表達研究.pdf

1、Rspo基因家族是新近發(fā)現(xiàn)的一個基因家族，包括4個家族成員，通過與胞膜蛋白FZD和LRP5/6相互作用而激活Wnt/β-catenin（β連環(huán)蛋白）信號途徑，對細胞增殖分化、個體發(fā)育以及腫瘤的生長轉(zhuǎn)移等進行調(diào)控。Rspo基因家族分布廣泛，在不同物種中具有很高的保守性。Rspo基因尤其是Rspo3基因，通過基因敲除手段研究其功能的時候，敲除了Rspo3基因的小鼠不能正常發(fā)育成活體，揭示了 Rspo3基因在動物個體發(fā)育中起著極為關(guān)鍵的作用，

2、但同時為進一步研究基因功能帶來很大的障礙。通過對豬Rspo3基因的研究，對豬的新品種選育、疾病防治等都有重大的意義。
　　本試驗利用PCR的方法，克隆得到了豬Rspo3基因，檢測了該基因的組織表達分布，并利用pET28a作為載體成功在大腸桿菌BL21中得到表達。為了進一步在真核細胞內(nèi)研究Rspo3基因功能，構(gòu)建了不同啟動子組合的真核表達載體，并對不同載體的表達效率進行了篩選。
　　1.利用電子克隆技術(shù)，設(shè)計了豬Rspo3基因

3、的擴增引物，以豬的肝臟提取的總RNA為模板，利用RT-PCR成功獲取了豬的Rspo3基因，經(jīng)過測序確認，豬Rspo3的開放閱讀框有828bp，編碼275個氨基酸，其中包含56個酸性氨基酸和62個堿性氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為31.32 KDa，等電點為：9.94，并對豬Rspo3的三維結(jié)構(gòu)進行了預測，蛋白分子三維尺寸為：X：44.486 Y：45.211 Z：47.410（單位：10-10米），屬于球狀蛋白質(zhì)。Rspo3基因在豬各個組織表達

4、分布檢測表明：Rspo3基因除了在脾和脂肪組織中幾乎很少表達外，其它常見組織中均有表達，其中在腦和睪丸表達豐度最高；
　　2.將豬Rspo3基因整合到pET28a原核表達載體上，在Rspo3基因前添加了6×His-Tag，便于后期檢測和純化，利用大腸桿菌BL21作為宿主菌，優(yōu)化后的豬Rspo3基因在大腸桿菌BL21中的表達條件為：溫度26℃時，0.5mg/ml的IPTG濃度，誘導時間為2h。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Wester

5、n blot檢測，確認成功表達了融合蛋白，分子量為35.19kDa；
　　3.用酶切連接技術(shù)將Rspo3基因與10個不同啟動子組合的真核表達載體（P1-P10）進行連接時，Rspo3自身所帶的NcoI酶切位點成為正常的酶切連接反應(yīng)的障礙。利用重疊延伸PCR的方法，先對豬Rspo3基因自身攜帶的NcoI酶切位點進行了同義突變，測序結(jié)果證實了突變獲得了成功，除了突變位點，其它序列保持了不變，編碼的氨基酸序列沒有改變。利用亞克隆的方法，

6、將突變后的Rspo3基因從T載體上NcoI和NheI雙酶切后與P1-P10相連，經(jīng)PCR、酶切和測序均驗證正確，成功的構(gòu)建了攜帶Rspo3基因的10個不同啟動子組合的真核表達載體；
　　4.在PK15細胞上的轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果表明，GFP蛋白表達的效率最高的P5質(zhì)粒，相對于對照組轉(zhuǎn)染peGFP-N1質(zhì)粒提高了458.9％，到第14天還能觀測到GFP熒光，P6質(zhì)粒的GFP表達效率僅次于P5質(zhì)粒。用Q-PCR檢測Rspo3效率P5質(zhì)粒和P6

7、質(zhì)粒顯著高于其它組，考慮到誤差因素和檢測目的分子的差異，最合適PK15細胞平臺的啟動子組合是P5質(zhì)粒所攜帶的CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ CMV(Human)；
　　5.對雞成纖維細胞DF1、犬腎細胞MDCK和人源的Hela細胞，也進行了不同啟動子組合的篩選，對不同細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果通過熒光顯微鏡檢測、GFP熒光吸光值測定和表達持續(xù)時間測定，在DF1細胞和MDCK細胞中表達效率最高的是P6質(zhì)粒，啟動子組合為

8、啟動子組合為CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ Sv40(Viral)。而在Hela細胞上表達效率最高的是P5質(zhì)粒，啟動子組合為CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ CMV(Human)。
　　綜上所述，本試驗成功的克隆得到豬Rspo3基因，首次對該基因的不同組織表達分布進行了檢測，在大腸桿菌BL21也成功獲得了蛋白表達。構(gòu)建了攜帶Rspo3基因不同啟動子組合的真核表達載體，并對不同啟