Rab40b-c相互作用蛋白質(zhì)的鑒定研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是專職抗原遞呈細(xì)胞，在免疫過(guò)程中精確調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)事件。Rab蛋白在天然免疫過(guò)程中系統(tǒng)整合一系列復(fù)雜的膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，起到重要調(diào)節(jié)作用。哺乳細(xì)胞內(nèi)有70多種Rab蛋白，分別參與特定的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。非洲爪蟾Rab40亞家族可以調(diào)節(jié)非經(jīng)典Wnt通路，而Wnt通路對(duì)樹突狀細(xì)胞的分化具有重要影響。因此對(duì)Rab40亞家族的研究可以為闡述Wnt通路調(diào)控樹突狀細(xì)胞功能奠定基礎(chǔ)。蛋白大分子通過(guò)形成蛋白復(fù)合物來(lái)執(zhí)行生

2、物學(xué)功能，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用(proteinproteininteraction，PPI)是研究蛋白質(zhì)功能的重要方法。目前蛋白相互作用研究技術(shù)各有優(yōu)劣，其中應(yīng)用廣泛的串聯(lián)親和純化質(zhì)譜也有其限制。因此在應(yīng)用高效的串聯(lián)親和純化技術(shù)上，對(duì)Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白的研究不僅對(duì)闡述Rab40b和Rab40c在對(duì)樹突狀細(xì)胞功能的影響上有重要意義，并且為闡述Wnt通路調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞分化過(guò)程的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　目的：

3、　　在新型串聯(lián)親和純化標(biāo)簽eXact-6×His的基礎(chǔ)上發(fā)展一種新型的串聯(lián)親和純化（tandemaffinitypurification，TAP）方案，并用此方法檢測(cè)樹突狀細(xì)胞中Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白。對(duì)蛋白復(fù)合物進(jìn)行分析鑒定及相互作用的驗(yàn)證，為進(jìn)一步闡述Rab40b和Rab40c蛋白復(fù)合物的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建相關(guān)表達(dá)載體質(zhì)粒
　　用RCR的方法擴(kuò)增出特異性Ra

4、b40b和Rab40c的DNA片段，再使用分子克隆技術(shù)將其導(dǎo)入FuGW-eXact-6×His-EYFP載體質(zhì)粒中，獲得FuGW-eXact-6×His-EYFP-Rab40b和FuGW-eXact-6×His-EYFP-Rab40c載體質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn)。PCR特異性擴(kuò)增TagRFP的DNA片段，經(jīng)過(guò)酶切連接等過(guò)程獲得FUGW-eXact-6×His-tagRFP-Rab40b載體質(zhì)粒。
　　2.建立穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的

5、樹突狀細(xì)胞系
　　將FuGW-eXact-6×His-EYFP-Rab40b、FuGW-eXact-6×His-EYFP-Rab40c和FUGW-eXact-6×His-tagRFP-Rab40b質(zhì)粒分別通過(guò)磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞獲得慢病毒。病毒感染樹突狀細(xì)胞系DC2.4，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選分別獲得穩(wěn)定表達(dá)eXact-6×His-EYFP-Rab40b、eXact-6×His-EYFP-Rab40c和eXact-6×His-

6、tagRFP-Rab40b融合蛋白的樹突狀細(xì)胞系。
　　3.使用新型串聯(lián)親和純化質(zhì)譜檢測(cè)樹突狀細(xì)胞中Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白并進(jìn)行生物信息學(xué)分析
　　構(gòu)建新型純化標(biāo)簽eXact-6×His，經(jīng)過(guò)兩次親和純化獲得Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白復(fù)合物。使用液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（HighPerformanceLiquidChromatography-electrospraryionization-m

7、assspectrometry，HPLC-ESI-MS）連用技術(shù)鑒定相互作用蛋白，經(jīng)過(guò)一個(gè)在CompPASS(ComparativeProteomicsAnalysisSoftwareSuite)算法上改進(jìn)的軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行一系列分析得到高可信相互作用蛋白(high-confidenceinteractingproteins，HCIP)。通過(guò)DVAID在線GO分析系統(tǒng)對(duì)相互作用蛋白生物學(xué)過(guò)程(biologicalprocess，BP)進(jìn)

8、行GO(geneontology)分析，以便分析其功能。
　　4.驗(yàn)證Rab40b和Rab40c蛋白復(fù)合物相互作用
　　通過(guò)對(duì)蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，選取一些蛋白進(jìn)行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其相互作用。其中對(duì)Rab40b和Rab40c的相互作用，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(Laserscanningconfocalmicroscopy，LSCM)觀察二者的共定

9、位，說(shuō)明二者的相互作用。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立穩(wěn)定表達(dá)eXact-6×His-EYFP-Rab40b、eXact-6×His-EYFP-Rab40c和eXact-6×His-tagRFP-Rab40b融合蛋白的DC2.4細(xì)胞系。
　　2.利用建立的新型串聯(lián)親和純化質(zhì)譜平臺(tái)分別鑒定了Rab40b和Rab40c的高可信相互作用蛋白26個(gè)和16個(gè)。
　　3.ElonginB、ElonginC、Cullin5和R