Rab32及其相互作用蛋白的鑒定分析.pdf

1、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是主要的一種抗原遞呈細(xì)胞，目前認(rèn)為DC細(xì)胞抗原遞呈的方式有三種：一種是DC細(xì)胞吞噬外來抗原，并加工處理形成表位肽，與MHCⅡ類分子結(jié)合，從而激活CD4+T細(xì)胞；另外一種指DC細(xì)胞將內(nèi)源性合成的蛋白處理與MHCⅠ類分子結(jié)合激活CD8+T細(xì)胞；Bevan 提出了一種新的DC細(xì)胞遞呈抗原的方式——交叉遞呈（cross presentation），它是指抗原遞呈細(xì)胞將外源性的抗原加工處理，負(fù)載到

2、MHCⅠ類分子表面形成復(fù)合物，從而激活初始CD8+T細(xì)胞引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的過程。交叉遞呈對(duì)于監(jiān)視組織中的腫瘤以及清除那些不能感染抗原遞呈細(xì)胞的病毒起著十分重要的作用。詳細(xì)了解DC細(xì)胞交叉遞呈的機(jī)制將有助于我們更好的找到抗腫瘤和抗病毒的途徑，為腫瘤和病毒感染的免疫治療提供新的線索。但是目前對(duì)于DC細(xì)胞交叉遞呈的調(diào)節(jié)機(jī)制研究甚少在前面的研究中，我們下調(diào)了57種活化型Rab蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)包括Rab32在內(nèi)的12種Rab蛋白與抗原交叉遞呈有

3、關(guān)。目前,Rab32蛋白在抗原交叉遞呈中的作用機(jī)制研究未明。因此，為了了解Rab32在抗原交叉遞呈當(dāng)中的工作機(jī)制，我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)Rab32及其相互作用蛋白進(jìn)行鑒定分析。
　　 細(xì)胞內(nèi)的生理活動(dòng)通常是通過多個(gè)蛋白間形成蛋白復(fù)合物而實(shí)現(xiàn)的，因此，要了解某種生理功能，就需要了解這種蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。由于經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法—酵母雙雜交，只能夠研究?jī)蓛傻鞍踪|(zhì)間的相互作用以及假陽(yáng)性率過高，串聯(lián)親和純化結(jié)合質(zhì)

4、譜技術(shù)的方法逐漸得到發(fā)展。
　　 目的：鑒定分析Rab32及其相互作用蛋白方法：1. Profinity eXact 標(biāo)簽在真核生物系統(tǒng)當(dāng)中的應(yīng)用在對(duì)蛋白質(zhì)的純化當(dāng)中，親和標(biāo)簽得到了廣泛的應(yīng)用。相對(duì)于其他標(biāo)簽而言，Profinity eXact 標(biāo)簽作為一種新發(fā)明的標(biāo)簽具有洗脫，結(jié)合通過同一標(biāo)簽完成，不需要額外的步驟去除目的蛋白上的標(biāo)簽殘留。由于利用該標(biāo)簽純化后，在目的蛋白上沒有殘留，因此，所得到的目的蛋白更符合本身的生物特性。

5、但是，Profinity eXact 標(biāo)簽在真核系統(tǒng)當(dāng)中還沒有得到應(yīng)用。
　　 因此，為了驗(yàn)證Profinity eXact 標(biāo)簽是否能夠在真核系統(tǒng)中很好的工作。我們構(gòu)建了Profinity eXact 標(biāo)簽融合表達(dá)EGFP的真核表達(dá)載體。利用磷酸鈣沉淀法，我們將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，使融合蛋白在293FT細(xì)胞中表達(dá)。然后，我們利用ProfinityeXact 標(biāo)簽對(duì)融合蛋白進(jìn)行了純化，并且利用熒光檢測(cè)和SDS-PAG

6、E 膠結(jié)合考染的方法對(duì)純化效果進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 2.鑒定分析Rab32及其相互作用蛋白為了鑒定Rab32的相互作用蛋白，我們構(gòu)建了慢病毒載體FUEHTagEGFP、FUEHTagEYFPRab32。隨后，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系DC2.4FUEHTagEGFP、DC2.4TagEYFPRab32。在純化過程中，我們對(duì)構(gòu)建的TAP 純化平臺(tái)的純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了穩(wěn)定的TAP 純化平臺(tái)。隨后，我們利用TAP 技術(shù)對(duì)Rab3

7、2 進(jìn)行純化，并且利用SDS-PAGE 結(jié)合銀染的方法對(duì)純化效果進(jìn)行驗(yàn)證。在獲得純化樣本后，我們對(duì)樣本進(jìn)行了質(zhì)譜分析，得到了可能是Rab32 相互作用蛋白的蛋白。串聯(lián)親和純化（TAP）
　　 包括兩次親和純化，每次純化所使用的純化標(biāo)簽不一樣。相對(duì)于親和純化而言，串聯(lián)親和純化提高了樣本的特異性，降低了背景雜蛋白的含量。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，串聯(lián)親和純化結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用，能夠更好，更精準(zhǔn)的檢測(cè)和鑒定分析蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，我們選擇串聯(lián)

8、親和純化結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的方法鑒定分析Rab32蛋白及其相互作用蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 1）我們首先成功構(gòu)建了Profinity eXact 標(biāo)簽的真核表達(dá)載體。然后，我們將ProfinityeXact 標(biāo)簽的真核表達(dá)載體通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。我們觀察到，融合蛋白在293FT細(xì)胞中表達(dá)良好。在純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)純化蛋白主要通過第一次洗脫從親和層析柱上洗脫下來。隨后，我們進(jìn)行SDS-PAGE 跑膠和考馬斯亮

9、藍(lán)染色，結(jié)果目的蛋白清晰可見。因此，我們認(rèn)為Profinity eXact 標(biāo)簽在真核系統(tǒng)當(dāng)中工作良好，能夠獲得良好的純化效果。2）我們首先構(gòu)建了串聯(lián)親和標(biāo)簽EH-Tag的慢病毒表達(dá)載體FUEHTagEGFP、FUEHTagEYFPRab32。然后，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系DC2.4FUEHTagEGFP、DC2.4FUEHTagEYFPRab32。隨后，我們發(fā)現(xiàn)在第一次純化的過程中合適的洗滌次數(shù)為7次，0.01M NaN3是洗脫效率

10、最高的洗脫液。在純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過兩次結(jié)合，兩次洗脫后，我們得到的蛋白質(zhì)量較少，因此，為了減少目的蛋白的損失，我們?cè)诘诙渭兓^程中只結(jié)合不洗脫。最后通過質(zhì)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與Rab32蛋白共同純化出來的蛋白，分別是Rab38、PHB、PHB2和MTA70我們得出結(jié)論：Profinity eXact 標(biāo)簽在真核系統(tǒng)中能夠有效的工作。我們利用質(zhì)譜對(duì)純化樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)蛋白，其中Rab38、PHB、PHB2 可能是Rab3