重組人粒細胞集落刺激因子的克隆、表達、純化和PEG單修飾以及修飾前后的體內外生物學活性.pdf

1、目的：構建、表達pJGW-2-G-CSF表達載體，表達產物G-CSF經純化后經PEG20k化學修飾，純化得到修飾產物PEG-G-CSF，測定修飾前后G-CSF體外和小鼠體內的生物學活性。 方法：酶切回收目的G-CSF DNA片段，將目的基因插入pJGW-2中構建成表達載體，轉化大腸桿菌，挑取單菌落提取質粒進行PCR鑒定。鑒定后的陽性克隆溫度誘導表達，表達產物經SDS-PAGE和免疫學鑒定正確后，純化包涵體，進行蛋白的變性、復性，

2、復性后蛋白再經離子交換和分子篩進行純化，得到純品G-CSF，薄層掃描儀掃描凝膠以檢測純度。用PEG20k單修飾G-CSF，修飾產物PEG-G-CSF經離子交換和分子篩進行純化，得到純品PEG-G-CSF，HPLC檢測純度。測定修飾前后的G-CSF體內外生物學活性。 結果：經PCR鑒定證明所構建質粒為pJGW-2-G-CSF重組質粒，SDS-PAGE證實表達后所獲得的融合蛋白分子量為19KD，表達量約占菌體總蛋白的40％，以不溶

3、的包涵體形式存在。Western blot印跡表明目的蛋白具有人G-CSF的抗原性。純化后產物SDS-PAGE電泳后經凝膠掃描儀掃描純度為95％。在G-CSF：PEG(mg/mg)為1:6，pH6.0，反應時間為48h，室溫下進行修飾反應時，G-CSF的單PEG修飾度最高，PEG-G-CSF達到45％左右。經純化后獲得純度大于95％的PEG-G-CSF。修飾前G-CSF的體外生物學活性為1.0x108μ/mg，修飾后G-CSF。的為2.

4、0x107μ/mg。經修飾，G-CSF的體外生物學活性下降，但在小鼠體內的作用時間延長，同時顯著增強了G-CSF在小鼠體內血漿中白細胞的增殖。 結論：成功構建pJGW-2-G-CSF表達載體，在大腸桿菌中獲得表達，獲得包涵體復性后的純化蛋白。建立了PEG-G-CSF的生產工藝；純化的G-CSF經PEG單修飾并純化得到純度大于95％的PEG-G-CSF。初步證明，經PEG單修飾后，G-CSF的體外生物學活性下降，但在小鼠體內的作