STAT3基因轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生物學(xué)特性觀察.pdf

1、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal and activators of transcription；STAT)是潛在的轉(zhuǎn)錄因子。在很多人類(lèi)癌癥和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中，活性的Stat3是阻礙細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必不可少的因子。近年來(lái)人們對(duì)Stat3的研究異常活躍，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示Star3在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中異常表達(dá)，并與腫瘤的增殖分化、免疫逃避、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本試驗(yàn)將攜帶有Stat3基因的質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入牛乳

2、腺上皮細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以及牛乳腺上皮細(xì)胞的永生化提供研究基礎(chǔ)。 1、采用膠原酶消化法和胰蛋白酶選擇性消化法分離、培養(yǎng)和純化牛乳腺上皮細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察表明，培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)特征。 2、應(yīng)用PCR技術(shù)從含有人Stat3基因的質(zhì)粒POTB7中擴(kuò)增Star3基因。將其克隆入真核表達(dá)載體PEGFP-C1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。 3、用含15％血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牛乳腺上

3、皮細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體2000將外源基因Stat3轉(zhuǎn)入牛乳腺上皮細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀測(cè)EGFP的表達(dá)，轉(zhuǎn)染24h后大約16％的細(xì)胞被導(dǎo)入含Stat3基因的重組表達(dá)質(zhì)粒用600 μg/mL G418篩選獲得陽(yáng)性克隆，然后換為含300 μg/mL G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)使陽(yáng)性克隆得到擴(kuò)增。 4、獲得的陽(yáng)性克隆提取RNA，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)電泳分析在2332bp處出現(xiàn)目的條帶，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無(wú)目的條帶。 5