穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組STAT3基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞增殖及侵襲的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用RNAi（RNA干擾）技術(shù)沉默STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3），篩選出能穩(wěn)定表達(dá)siRNA-STAT3基因的細(xì)胞系，觀察對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖力及侵襲力的影響，在蛋白水平上進(jìn)一步探討STAT3作用于Hep-2細(xì)胞增殖和侵襲可能的機(jī)制。以尋找抑制喉癌增殖和侵襲的新方法，為臨床通過基因沉默技術(shù)治療喉癌提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。
　　 方法：構(gòu)建重組質(zhì)粒真核表達(dá)載體PGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3，將重組

2、表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體LipofactaminTM2000轉(zhuǎn)染人喉癌Hep-2細(xì)胞，通過G418持續(xù)單克隆篩選，Western-blot印跡法鑒定，進(jìn)而篩選出穩(wěn)定表達(dá)siRNA-STAT3的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)分為三組：siRNA-STAT3組、siRNA-shNC組及空白對(duì)照組。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CyclinD1、P21、ICAM-1、VEGF蛋白水平的表達(dá)情況及細(xì)胞周期的變化；采用MTT法觀察接種培養(yǎng)板1d、2d、3d、4d、5d、6d后喉癌He

3、p-2細(xì)胞增殖狀態(tài)；MTT法觀察其粘附性的變化；細(xì)胞劃痕法觀察其遷移性；Transwell法檢測其侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)構(gòu)建了重組pGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3質(zhì)粒載體通過模板退火和載體的線性化等步驟，構(gòu)建了重組質(zhì)粒表達(dá)載體。酶切結(jié)果表明，所有質(zhì)粒均為陽性重組載體。
　　 (2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染與G418篩選熒光顯微鏡下觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染6小時(shí)后較多Hep-2細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白(GF

4、P)表達(dá)，24小時(shí)后GFP表達(dá)明顯增強(qiáng)。G418篩選結(jié)果顯示空白對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡，而siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染組和siRNA-shNC轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞出現(xiàn)明顯而且數(shù)量較多的細(xì)胞克隆集落形成。
　　 (3)Western-blot鑒定p-STAT3的表達(dá)結(jié)果顯示siRNA-STAT3組的p-STAT3的表達(dá)明顯減少，而siRNA-shNC組和空白對(duì)照組細(xì)胞p-STAT3的表達(dá)未見有下降。
　　 (4)MTT檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)

5、Hep-2細(xì)胞在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA-STAT3后，同空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA-shNC無關(guān)質(zhì)粒組比，2天后就開始表現(xiàn)出較明顯的抑制效應(yīng)(P＜0.05)，即使6天后在對(duì)照組細(xì)胞生長變緩時(shí)，siRNA-STAT3組Hep-2細(xì)胞生長抑制仍較明顯(P＜0.05)，故其抑制效應(yīng)隨時(shí)間延長愈明顯，并表現(xiàn)出一定的時(shí)間抑制效應(yīng)關(guān)系。
　　 (5)平板克隆形成試驗(yàn)2周后，觀察三組均有一定的單克隆集落形成。結(jié)果顯示siRNASTAT3組Hep-

6、2細(xì)胞克隆形成率為（15.17±2.32）％明顯低于siRNA-shNC組（24.33±1.97）％及空白對(duì)照組（26.33±2.16）％(P＜0.05)。
　　 (6)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期應(yīng)用FCM檢測細(xì)胞周期分布，轉(zhuǎn)染重組siRNA-STAT3質(zhì)粒的Hep-2細(xì)胞G1期比率由（60.7±0.9）％上升至（66.0±2.0）％(P＜0.05)，S期所占比率由（34.8±1.1）％降至(24.6±1.9)％(P＜0.

7、05)。
　　 (7)FCM檢測CyclinD1、P21、ICAM-1、VEGF蛋白的表達(dá)觀察siRNA-STAT3組CyclinD1、ICAM-1、VEGF蛋白表達(dá)熒光指數(shù)分別為0.71±0.08(P＜0.05)、0.83±0.06(P＜0.05)、0.74±0.02(P＜0.05)，均低于siRNA-shNC組，siRNA-STAT3組P21蛋白表達(dá)熒光指數(shù)（1.39±0.10）則高于siRNA-shNC組(P＜0.05)。

8、
　　 (8)細(xì)胞黏附試驗(yàn)應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的粘附性，接種96孔培養(yǎng)板20分鐘后觀察各組細(xì)胞的黏附率相差不大(P＞0.05)，但有一定的趨勢性，40分鐘后siRNA-STAT3組的黏附率小于siRNA-shNC組和空白對(duì)照組(P＜0.05)，這種抑制效應(yīng)在60分鐘后更加明顯(P＜0.05)。
　　 (9)細(xì)胞遷移試驗(yàn)接種培養(yǎng)板48小時(shí)后，熒光顯微鏡下見空白對(duì)照組和siRNA-shNC組的Hep-

9、2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長速度明顯快于siRNA-STAT3組，而空白對(duì)照組和siRNA-shNC組的Hep-2細(xì)胞向劃痕區(qū)生長速度差異不明顯。
　　 (10)體外侵襲試驗(yàn)各組細(xì)胞接種Transwell小室上室內(nèi)24小時(shí)后，400×光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野中觀察siRNA-STAT3組穿過Matrigel基質(zhì)和濾膜的細(xì)胞（85.20±4.92）明顯少于空白對(duì)照組（122.8±7.50）和siRNA-shNC組(126.4±8.73)(P

10、＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了重組pGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3質(zhì)粒載體。
　　 2、應(yīng)用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)siRNA-STAT3基因的喉癌Hep-2細(xì)胞系。
　　 3、抑制STAT3的活性后Hep-2細(xì)胞周期形成G1期阻滯，其增殖能力和單克隆形成能力均明顯下降。說明喉癌細(xì)胞具有無限增殖能力與STAT3的高表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)。
　　 4、本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干

11、擾技術(shù)沉默STAT3活性發(fā)現(xiàn)能抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的粘附、遷移及侵襲能力。推測表達(dá)STAT3基因的喉癌細(xì)胞因提高了其黏附、遷移和降解基質(zhì)的能力而增加了侵襲到達(dá)周圍的組織及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并定植生長的機(jī)會(huì)。說明STAT3在喉癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。
　　 5、阻斷STAT3信號(hào)通路后，STAT3下游調(diào)控蛋白CyclinD1、VEGF、ICAM-1的表達(dá)降低，而P21蛋白的表達(dá)升高。提示CyclinD1、P21、VEGF、ICAM