Pim-3基因轉(zhuǎn)染對大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景與總體思路: 腸道是體內(nèi)最大的貯菌庫和內(nèi)毒素庫，但是在正常情況下，腸屏障能阻止腸道內(nèi)細(xì)菌及其分解產(chǎn)物經(jīng)腸壁擴(kuò)散至機(jī)體內(nèi)。在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等應(yīng)激狀況下，腸道屏障功能受損，腸內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素發(fā)生易位，腸道內(nèi)微生物和內(nèi)毒素可通過受損的腸粘膜屏障侵入到體循環(huán)，形成腸源性感染，可導(dǎo)致多器官功能障礙。因此，腸屏障功能已成為判斷危重患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。目前人們在腸源性感染的病因和機(jī)制方面作了大量研究，而對燒傷及內(nèi)毒素作用后腸道

2、生物屏障的變化及相關(guān)的基因治療報(bào)道較少。因此，如何保護(hù)腸黏膜屏障功能成為當(dāng)前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。以前這方面的研究思路主要集中在腸內(nèi)營養(yǎng)及恢復(fù)腸內(nèi)正常微生態(tài)環(huán)境上，而利用原癌基因治療腸黏膜損傷卻少有涉及。為此本研究以30％TBSA燙傷大鼠及內(nèi)毒素?fù)p傷大鼠為模型，對燒傷后腸道生物屏障的動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)觀察，并進(jìn)行了體外腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)，觀察原癌基因治療對內(nèi)毒素性腸上皮細(xì)胞的影響。 原癌基因絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-3

3、，它廣泛表達(dá)于人類各種組織細(xì)胞中，以腎臟、肝臟和胰腺表達(dá)較高，可促進(jìn)MAPK磷酸化，參與多個(gè)細(xì)胞信號通路的調(diào)控。原癌基因絲/蘇氨酸激酶Pim-3具有促進(jìn)細(xì)胞生長和抑制凋亡的功能，在損傷組織的修復(fù)、治療中發(fā)揮積極作用。所有這些均表明Pim-3有可能與腸道的損傷和功能有著密切的關(guān)系。很多原癌基因在腸道黏膜受損后都具有增量調(diào)節(jié)的作用。例如，c-fos、c-jun、egr-1、sp-1、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、三葉肽、表皮生長因子受體、肝細(xì)

4、胞生長因子、c-met、成纖維細(xì)胞生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子，所有這些基因產(chǎn)物都扮演著一個(gè)重要的修補(bǔ)角色，協(xié)助修復(fù)受損的腸黏膜。這些原癌基因整合的功能和他們的產(chǎn)物，都具備重要的修復(fù)特性?；谶@一點(diǎn)，本課題將主要研究Pim-3基因?qū)δc黏膜屏障功能即腸上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的影響。為此設(shè)想，Pim-3可能在急性燒傷大鼠腸屏障功能的損害中發(fā)揮作用，并可能作為細(xì)胞內(nèi)的一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，對減輕燒傷引起的腸粘膜損傷起著重要的保護(hù)作用。 本實(shí)

5、驗(yàn)的總體研究思路為： 首先，建立嚴(yán)重燙傷大鼠模型，內(nèi)毒素處理大鼠模型，通過檢測腸道機(jī)械屏障標(biāo)記物之一閉鎖蛋白(Occludin)以及細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、腫瘤壞死因子：α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和病理結(jié)果及Pim-3 mRNA和蛋白水平，旨在明確①48小時(shí)內(nèi)腸屏障損傷、ICAM-1和Pim-3的表達(dá)規(guī)律，并分析Pim-3與腸屏障損傷及炎性因子TNF-α、IL-6之間的時(shí)效關(guān)系，并探討這些變化的相關(guān)性。②分

6、析內(nèi)毒素和燒傷處理后的動(dòng)物，相關(guān)指標(biāo)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為體外試驗(yàn)提供依據(jù)。 然后，根據(jù)上部分的研究結(jié)果，以原代腸上皮細(xì)胞為研究對象，模擬燒傷時(shí)對腸上皮細(xì)胞的直接影響，建立內(nèi)毒素性腸上皮細(xì)胞損傷模型。將Pim-3轉(zhuǎn)染入腸上皮細(xì)胞用于防治內(nèi)毒素性損傷，利用RT-PCR檢測各項(xiàng)指標(biāo)Occludin、ICAM-1及IL-6、TNF-α和Pim-3等，并利用流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞凋亡情況，研究Pim-3對腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及對炎癥因子表達(dá)

7、方式的影響。從細(xì)胞和分子生物學(xué)水平，探討Pim-3保護(hù)腸上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。 第一部分：(體內(nèi)試驗(yàn))急性燒傷大鼠Pim-3基因表達(dá)的變化及腸屏障損害的相關(guān)研究 目的:用燒傷儀制做成年大鼠嚴(yán)重?zé)齻Ｐ?Ⅲ°，30％TBSA)，內(nèi)毒素處理大鼠模型。通過檢測燒傷后48h內(nèi)不同時(shí)段大鼠回腸病理及腸屏障功能損傷等公認(rèn)指標(biāo)，采用RT-PCR及western blotting等分子生物學(xué)方法檢測Pim-3及相關(guān)指標(biāo)的變化，從整體動(dòng)物水

8、平，研究燒傷后腸屏障的損傷，以及Pim-3的變化。目的在于證實(shí)燒傷和內(nèi)毒素對內(nèi)源性Pim-3基因在腸道表達(dá)的影響及Pim-3基因與腸黏膜損傷的相關(guān)性。 方法:將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組：A組.燒傷組(n=30)；B組.內(nèi)毒素(LPS)組(n=30)：C組.正常對照組(n=6)。各組依次在處理后3h、6h、12h、24h、48h取回腸組織，進(jìn)行常規(guī)HE染色做病理切片，提取總RNA及總蛋白，并進(jìn)行RT-PCR及Western blott

9、ing印跡法分別檢測內(nèi)源性Pim-3、Occludin、ICAM-1、IL-6、TNF-α在腸道的表達(dá)。 結(jié)果: 1、粘膜形態(tài)學(xué)改變經(jīng)HE染色可見燒傷后3h絨毛出現(xiàn)水腫，腸粘膜固有層充血、出血，炎性細(xì)胞浸潤，表皮脫落，以傷后12h損傷最嚴(yán)重，傷后48h腸粘膜病變還未恢復(fù)正常；內(nèi)毒素組傷后6h上述變化加重，以傷后12h變化最明顯；燒傷組與內(nèi)毒素組腸粘膜形態(tài)出現(xiàn)了同樣改變，正常對照組無明顯變化。 2、Pim-3的水平

10、：正常大鼠回腸組織Pim-3 mRNA和蛋白水平低表達(dá)，燒傷組及內(nèi)毒素組內(nèi)源性Pim-3 mRNA和蛋白水平在3小時(shí)表達(dá)開始增多，6小時(shí)到達(dá)頂點(diǎn)，12小時(shí)開始下降，24小時(shí)、48小時(shí)低表達(dá)。燒傷組、內(nèi)毒素組內(nèi)源性Pim-3基因表達(dá)與c組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，燒傷組分別為對照組的12.25±1.24，21.13±1.78，14.21±1.12，2.12±0.11，1.08±0.97倍；內(nèi)毒素組分別為對照組的15.08±2.07，25.2

11、4±2.11，16.32±0.23，2.15±1.23，1.10±0.87倍；燒傷組、內(nèi)毒素組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、腸機(jī)械屏障的損害：在燒傷組，western blotting分析證實(shí)occludin蛋白水平在3小時(shí)和6小時(shí)升高。RT-PCR方法示燒傷后3h、6h、12h、24h、48h閉鎖蛋白mRNA量升高，分別為對照組的3.25±0.26、6.65±0.24.、3.10±0.8，1.55±0.9，1.01±0.22倍

12、；內(nèi)毒素組3h、6h、12h、24h、48h分別為對照組的3.15±0.55，6.25±0.56，2.52±0.78，1.42±0.3，1.05+0.2倍。內(nèi)毒素組與燒傷組比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無顯著性差異。 4、ICAM-1的表達(dá)：燒傷組、內(nèi)毒素組ICAM-1 mRNA的表達(dá)與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；燒傷組、內(nèi)毒素組ICAM-1的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。燒傷及內(nèi)毒素處理后ICAM-1 mRNA量增加，以傷后12h升高明顯。燒傷組3h

13、、6h、12h、24h、48h為對照組的55.12±5.32，82.16±5.68，88.31±7.41，58.16±4.56，56.12±3.89倍；內(nèi)毒素組3h、6h、12h、24h分別為對照組的37.81±4.48,89.68±6.67,58.43±5.67，53.24±4.36，88.12±6.21倍。內(nèi)毒素組與燒傷組比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無顯著性差異。 5、炎癥因子：正常腸組織IL-6、TNF-α無表達(dá)。燒傷及內(nèi)毒素促使IL

14、-6、TNF-α表達(dá)。燒傷組TNF-α為正常組的30.12±0.87,76.12±5.87,63.27±0.91，59.45±0.65,55.36±0.63倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論:在燒傷大鼠及內(nèi)毒素作用下大鼠，Pim-3作為內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)在損傷的腸粘膜中高表達(dá)；occludin做為腸道屏障的指標(biāo)在不同的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)升高和降低:IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)的情況。 第二部分：(體外實(shí)驗(yàn))Pim-3保

15、護(hù)內(nèi)毒素性腸上皮細(xì)胞損傷機(jī)制的初步探討 目的:觀察Pim-3在內(nèi)毒素性腸上皮細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用。 方法:以Wistar乳鼠原代培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞加入終濃度為0.5ug/ml的內(nèi)毒素(LPS)，建立LPS損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為6組：①正常對照組+內(nèi)毒素處理組；②空載質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染+內(nèi)毒素處理組；③重組質(zhì)粒pEGFP-N2/Pim-3轉(zhuǎn)染+內(nèi)毒素處理組；④正常對照組；⑤空載質(zhì)粒 pEGFP-N2轉(zhuǎn)染組；⑥重組質(zhì)粒pEG

16、FP-N2/Pim-3轉(zhuǎn)染組。每次實(shí)驗(yàn)為復(fù)孔，重復(fù)4次。內(nèi)毒素濃度(0.5ug/ml)，內(nèi)毒素處理6小時(shí)后，提取各組總RNA，利用RT-PCR法檢測occludin、Pim-3各項(xiàng)指標(biāo)，并利用流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞凋亡情況。RT-PCR測定細(xì)胞內(nèi)ICAM-1、IL-6，TNF-α水平。探討Pim-3保護(hù)LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。 結(jié)果: 1、腸上皮細(xì)胞損傷：③組的細(xì)胞凋亡及oecludin、ICAM-1的表達(dá)與①

17、-②組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，③組可使細(xì)胞凋亡下降、升高oceludin蛋白的表達(dá)、降低ICAM-1的表達(dá)。⑥組的細(xì)胞凋亡及occludin、ICAM-1的表達(dá)與④⑤組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而④⑤⑥組之間occludin、ICAM-1的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是，④⑤⑥組的ICAM-1表達(dá)與①②③組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 2、促炎癥因子反應(yīng)：IL-6與TNF-α:④⑤⑥組之間IL-6與TNF-α無表達(dá)；③組的IL-6與TNF