PCR方法鑒別早期胚胎性別及相關(guān)技術(shù)的研究.pdf

1、本論文研究了小鼠和牛早期胚胎的徒手切割取樣方法、切割取樣胚胎冷凍—解凍方法和PCR方法鑒別牛早期胚胎性別技術(shù)，并應(yīng)用牛Y-染色體特異引物PCR擴(kuò)增牛、牦牛、山羊、綿羊、小鼠、豬等6個動物基因組，克隆測定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。試驗結(jié)果表明： 1.體視顯微鏡下，應(yīng)用玻璃切割針徒手切割取樣小鼠和牛胚胎，切割取樣后胚胎體外培養(yǎng)48小時的發(fā)育率分別為76.7﹪(46/60)和80﹪(16/20)，牛新鮮胚胎和冷凍—解凍胚胎切割取樣后移植妊娠率分

2、別為47.1﹪(8/19)和42.9﹪(6/17)。 2.分別以10﹪甘油、10﹪乙二醇作為冷凍液以及在以上兩種冷凍液中分別添加10﹪葡聚糖+0.1M蔗糖作為冷凍液常規(guī)冷凍方法冷凍切割后的小鼠胚胎，冷凍—解凍后體外培養(yǎng)72小時總發(fā)育率分別為56.9﹪(259/455)，81.8﹪(317/)，84.8﹪(540/738)和59.5﹪(308/518)。取樣后胚胎體外短暫培養(yǎng)(0-4小時)并不能提高切割取樣后小鼠胚胎冷凍—解凍體外

3、培養(yǎng)發(fā)育率。 3.切割取樣小鼠胚胎快速冷凍體外培養(yǎng)發(fā)育率為73.3﹪(33/45)，切割取樣牛胚胎在25﹪甘油+0.25M蔗糖+20﹪血清的PBS為冷凍液快速冷凍后移植妊娠率為57.1﹪(4/7)。 4.依據(jù)牛Y染色體特異序列設(shè)計合成5對Y染色體特異引物，依據(jù)牛骨胳肌α肌動蛋白前體基因和微衛(wèi)星DNA序列設(shè)計合成4對牛DNA特異內(nèi)標(biāo)引物。應(yīng)用合成的引物單重PCR擴(kuò)增牛血樣DNA，篩選到4對牛Y染色體特異引物和一對牛DNA特

4、異內(nèi)標(biāo)引物。應(yīng)用所篩選的4對牛Y-染色體特異引物和內(nèi)標(biāo)引物分別PCR擴(kuò)增牛基因組DNA、成纖維細(xì)胞和胚胎，篩選出2個可用于牛胚胎性別鑒別的多重PCR引物組合：B34/A12、B78/A12。建立了兩溫度循環(huán)PCR方法(94℃變性15s和55℃退火15s，以94℃變性1s和55℃退火1s)并鑒別牛胚胎性別，將PCR擴(kuò)增時間減少到50分鐘左右。 5.設(shè)計合成的5對牛Y-染色體特異引物都可以擴(kuò)增牛和牦牛Y-染色體，引物B90在綿羊中也