應(yīng)用PCR法和LAMP法鑒定牛早期胚胎性別的研究.pdf

1、在畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，往往需要人為控制家畜的性別及比例，加速優(yōu)良品種繁育，擴(kuò)大優(yōu)良母畜的利用率，因而，性別控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)上具有重要的意義。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，特別是牛羊胚胎工程產(chǎn)業(yè)化的迅速發(fā)展，運(yùn)用性別控制技術(shù)來(lái)加快這種產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程顯得越來(lái)越重要。本研究旨在通過(guò)用PCR法、LAMP法進(jìn)行牛早期胚胎性別鑒定的研究和應(yīng)用，從而確立可以在實(shí)際應(yīng)用中被推廣的性別控制方法，提高養(yǎng)殖場(chǎng)和農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)效益，進(jìn)而推動(dòng)新疆乃至全國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。本研究主

2、要做了以下方面的研究：1.通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，改變Mg2+濃度、退火溫度、調(diào)整循環(huán)條件等影響PCR的因素，并且經(jīng)過(guò)不同樣品的驗(yàn)證，最終確定適合生產(chǎn)實(shí)踐的PCR反應(yīng)體系為：雙重PCR反應(yīng)體系總體積為25μl:2.5μl10×Buffer，1.5mMMg2+，0.2mMdNTP，2UTaqDNA聚合酶，性控引物濃度為0.4μM(P0)，內(nèi)標(biāo)引物濃度為0.15μM(P4)(性控和內(nèi)標(biāo)引物可單獨(dú)加入同一反應(yīng)液里)。94℃預(yù)變性5min，94℃3

3、0s，55℃30s，72℃30s；72℃延伸5min，33個(gè)循環(huán)。 巢式PCR第一次反應(yīng)體系總體積為10μl：1μl10×Buffer，2.5mMMg2+，0.2mMdNTP，1UTaqDNA聚合酶，各引物濃度(P1，P5)為0.1uM。94℃預(yù)變性4min，94℃30s，63℃30s，72℃30s；72℃延伸2min，20個(gè)循環(huán)；第二次反應(yīng)體系總體積為20μl，2μl10×Buffer，2.5mMMg2+，0.2mMdNTP，

4、2UTaqDNA聚合酶，各引物濃度均為0.25μM。94℃預(yù)變性5min，94℃30s，63℃30s，72℃30s；72℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)。 通過(guò)不同樣品的試驗(yàn)和46枚胚胎現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用，證明建立的PCR胚胎性別鑒定方法可用于生產(chǎn)實(shí)踐。 2.LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)法是一種新的基因擴(kuò)增技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)；通過(guò)不同樣品、現(xiàn)場(chǎng)126枚常規(guī)胚胎