GeXP多重PCR技術(shù)鑒別多個(gè)鹿種的方法研究.pdf

1、鹿類動(dòng)物在古代典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中曾被記載其溫腎壯陽、益精補(bǔ)血之功效。隨著2000年將梅花鹿和馬鹿列入《中華人民共和國藥典》（一部）正品藥材，以梅花鹿馬鹿為主的高值鹿類產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用逐漸增多，如鹿茸、鹿鞭等高值藥材。然而隨之而來國內(nèi)外各類鹿產(chǎn)品的真假難辨和參差不齊等問題，對消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)、安全、及特殊的宗教信仰造成干擾和威脅。為了打擊高值鹿產(chǎn)品的商業(yè)欺詐行為，同時(shí)為了防止少數(shù)野生珍稀鹿類動(dòng)物如白唇鹿等資源遭受非法捕殺和利用

2、，建立科學(xué)、特異、準(zhǔn)確、高通量的鹿種間鑒別方法十分必要。
　　針對上述鑒別需求，本研究基于GeXP多重PCR技術(shù)建立了可區(qū)分梅花鹿、馬鹿、馴鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿等6種鹿類動(dòng)物的種間區(qū)分體系，主要研究工作和結(jié)果如下：
　　1.參考DNAMAN對各鹿種線粒體D-loop、cytb、16S rRNA基因組的堿基序列比對結(jié)果設(shè)計(jì)和篩選了梅花鹿和馬鹿、馬鹿、馴鹿、麋鹿、黇鹿、白唇鹿等6鹿種共150余對引物對，并成功確定了可特異區(qū)分6

3、鹿種的特異性靶基因，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度分別為馬鹿283 bp，馴鹿為107 bp，麋鹿為157 bp，黇鹿為167 bp，白唇鹿為187bp，馬鹿/梅花鹿316bp，經(jīng)單重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳和GeXP片段分析試驗(yàn)證明所設(shè)計(jì)引物均僅對各自鹿種有效，能特異準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增相應(yīng)鹿種。
　　2.采用單因素分析法依次對GeXP多重PCR體系中3類DNA聚合酶、6組不同引物退火溫度和3組不同引物濃度比進(jìn)行了優(yōu)化，對各引物對驗(yàn)證其交叉特異性，通過

4、多次調(diào)整反復(fù)試驗(yàn)確定了適應(yīng)本研究所建方法的各項(xiàng)理想?yún)?shù)，建立了特異靈敏、清晰分辨的檢測體系。
　　3.建立了用于馬鹿產(chǎn)品鑒偽的馬鹿、麋鹿、馴鹿、黇鹿GeXP四重PCR體系、和包含國家二類保護(hù)動(dòng)物白唇鹿在內(nèi)的馬鹿、麋鹿、馴鹿、黇鹿、白唇鹿的GeXP五重PCR體系；建立了梅花鹿和馬鹿產(chǎn)品的鑒偽GeXP六重PCR體系，該體系可以準(zhǔn)確鑒定馬鹿、麋鹿、馴鹿、黇鹿、白唇鹿，以及無馬鹿成分條件下的梅花鹿成分，僅對梅花鹿馬鹿混合品無法區(qū)分。

5、>　　4.以本實(shí)驗(yàn)所建立GeXP多重PCR方法對包含12份市售采集樣品和4份本實(shí)驗(yàn)室收集樣品共16份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果相應(yīng)特征峰清晰。表明該方法靈敏
　　5.特異，可對鹿類動(dòng)物種間區(qū)分、特定鹿種成分、以及鹿類產(chǎn)品中鹿源性成分實(shí)行有效可靠的鑒定。
　　目前國內(nèi)外能一次實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)多種鹿類動(dòng)物鑒別的研究十分少數(shù)，多重PCR技術(shù)領(lǐng)域尚未實(shí)現(xiàn)4重以上鹿種鑒別研究，而運(yùn)用GeXP多重PCR技術(shù)進(jìn)行鹿種區(qū)分的研究還未見報(bào)道，因此本研