兔早期胚胎PCR性別鑒定體系的建立.pdf

1、本試驗根掘兔SRY基因序列設(shè)計兩對引物作為兔雄性特異性引物；根據(jù)兔APP基因序列設(shè)計3對常染色體引物作為內(nèi)標引物。根據(jù)這些引物組合建立了兔早期胚胎性別鑒定的雙重和巢式PCR反應(yīng)體系。針對所建立的雙重和巢式PCR體系進行了不同擴增條件的篩選和優(yōu)化，并對巢式PCR結(jié)果進行了電泳法和非電泳法檢測的比較。同時將兔SRY基因序列分別與人、牛、綿羊和小鼠SRY基因進行了同源性比較，并用本試驗中所采用的SRY巢式引物分別對人、牛、綿羊和小鼠基因組DN

2、A及沖卵液進行擴增，檢測分析引物的特異性和分析胚胎性別鑒定過程中可能存在的污染因素。 用24只公兔、9只母兔的血液和肝臟組織基因組DNA樣品進行多重和巢式PCR擴增。結(jié)果表明，多重PCR擴增公兔基因組，可以擴增出282bp的SRY基因片斷和173bp的APP基因片斷，母兔只能擴增出173bp的APP基因片斷，擴增靈敏度為100pg；巢式PCR兩輪擴增后均進行電泳法和非電泳法檢測擴增產(chǎn)物，結(jié)果表明公兔基因組DNA擴增出282bp的

3、SRY基因片段(電泳法)，在紫外分析儀下管內(nèi)有明亮的熒光(非電泳法)，母兔沒有擴增產(chǎn)物也無熒光，擴增靈敏度為10pg。多重PCR擴增靈敏度明顯低于巢式PCR擴增。但兩種PCR擴增性別鑒定結(jié)果均與實際性別完全一致，準確率為100﹪。 對12只母兔分別用進口FSH+hCG(8只)和PMSG+hCG(4只)進行超數(shù)排卵處理，F(xiàn)SH+hCG組(排卵點72.4±13.6，胚胎52.6±14.4)比PMSG+hCG組(排卵點32±6，胚胎2

4、1.8±4.2)獲得了更好的超排效果(P＜0.01)。將部分胚胎移植給4只同期化處理的母兔，懷孕2只，其中一只妊娠20天流產(chǎn)，另一只順利產(chǎn)下8只小兔。部分超排胚胎用BIO-RAID顯微操作儀和徒手切割法比較，結(jié)果表明，兔早期胚胎采用徒手切割法更靈活、簡便，易于在生產(chǎn)現(xiàn)場進行操作，但此方法要達到精確控制取樣細胞數(shù)量需要反復(fù)練習操作技巧。 用本試驗建立的PCR反應(yīng)體系，對46枚超排胚胎性別鑒定結(jié)果表明，多重PCR只能對32細胞及以上

5、胚胎細胞獲得準確鑒定，不能作為兔胚胎PCR性別鑒定的應(yīng)用；巢式PCR可以對8分胚(約4細胞)進行準確鑒定(同一胚胎擴增符合率100﹪)，而且電泳法與非電泳法檢測結(jié)果一致。 兔SRY基因序列與其他幾種哺乳動物(人、牛、綿羊、小鼠)同源性分析結(jié)果表明，兔SRY基因序列與牛、綿羊和小鼠SRY基因序列同源性在80﹪～82﹪之間，與人的為87﹪，且在本試驗所設(shè)計的SRY基因引物，只對兔雄性特異，其他動物(人、牛、綿羊、小鼠)雄性DNA及沖