水牛SRY基因及胚胎性別鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、本論文研究內(nèi)容是水牛SRY基因和胚胎性別鑒定PCR體系的建立和優(yōu)化。論文共分為兩部分：第一部分，包括第一章和第二章，為文獻綜述部分；第二部分，包括第三章和第四章，為試驗研究部分。 第三章研究目的是通過對水牛SRY基因的克隆、序列分析及Southern雜交檢測，為進一步研究SRY基因的作用機理和設(shè)計特異于水牛SRY基因的胚胎性別鑒定引物打下基礎(chǔ)。根據(jù)荷斯坦牛SRY基因設(shè)計一對引物，PCR擴增后得到水牛SRY基因，測序后分析表明，該

2、基因長度為2005bp，其中1～504bp為5’啟動子區(qū)(Promoter)，1196～2005bp為3’側(cè)翼序列(UTR)，505～1195bp為SRY的讀碼框(ORF)。將該基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號為DQ417872)。BLAST比對顯示，與牛屬動物的同源性為95﹪～96﹪，其中HMG-box區(qū)的同源性高達99﹪，具有高度的進化保守性。使用ClustalX對水牛SRY基因外顯子區(qū)域做多重比對分析后，構(gòu)建部分哺乳動物

3、系統(tǒng)進化樹，與實際進化關(guān)系保持很好的一致。在SRY基因保守區(qū)設(shè)計探針，分別對雄性水牛和雌性水牛基因組進行Southern雜交，只在雄性水牛出現(xiàn)雜交信號，說明SRY基因為雄性特異。 第四章研究目的是建立并優(yōu)化水牛胚胎性別鑒定的PCR體系，以便該項技術(shù)能在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。根據(jù)第三章中水牛SRY基因核心序列設(shè)計兩對特異于水牛的性別鑒定引物SA1/SA2、SB1/SB2，根據(jù)小鼠ZFX/ZFY基因和水牛G3PDH基因分別設(shè)計內(nèi)參引物Z

4、A1/ZA2、GA1/GA2。對不同哺乳動物的DNA進行特異性檢測和梯度濃度的公水牛DNA進行敏感性檢測以篩選出最佳引物。分別使用煮沸法、蛋白酶K+Tween20法、Tween20+DTT法裂解胚胎樣品，擴增雌雄共有的G3PDH基因，比較擴增結(jié)果篩選出最佳的胚胎裂解方法。結(jié)果顯示，1)引物SB1/SB2、GA1/GA2擴增結(jié)果較好，分別作為檢測引物和內(nèi)參引物；2)三種處理方法的有效檢出率分別為85.3﹪(29/34)、97.1﹪(33/

5、34)和97.1﹪(33/34)，后兩種處理方法的擴增效率高于煮沸法，為簡化操作，選取DTT+Tween20法。 對篩選出的引物SB1/SB2和GA1/GA2設(shè)計一對巢式引物SB3/SB4、GA3/GA4，建立多重巢式PCR體系，對不同Mg2+濃度、不同dNTPs濃度、不同引物濃度比例和不同循環(huán)數(shù)進行多次試驗以優(yōu)化多重巢式PCR反應(yīng)體系。采用以上優(yōu)化后PCR反應(yīng)體系，對27枚水牛桑椹胚和24枚Y精子受精的IVF胚胎進行性別鑒定，

6、并使用斑點雜交方法驗證PCR擴增準確率，結(jié)果顯示，1)多重巢式PCR體系中，Mg2+濃度為1.5mM，dNTPs濃度為100μM；引物SB3/SB4、GB3/GB4濃度分別為0.5μM、0.25μM時擴增效果較好，循環(huán)數(shù)以35為宜；2)27枚水牛桑椹胚可鑒定率為100﹪，雄性比例為51.9﹪(14/27)，雌性比例為48.1﹪(13/27)。斑點雜交結(jié)果表明擴增準確率為100﹪；3)Y精子受精胚胎鑒定結(jié)果中雄性比例為83.3﹪(20/2