應(yīng)用巢式PCR法鑒定牛早期胚胎性別的研究.pdf

1、本文研究了巢式PCR法鑒定牛胚胎性別的技術(shù)，并優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以期該技術(shù)能在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。試驗(yàn)結(jié)果如下： 利用所選用的引物組合建立了基本的PCR反應(yīng)體系，研究了該反應(yīng)體系中Mg<'2+>濃度、Taq酶含量、引物濃度、退火溫度以及循環(huán)次數(shù)對PCR擴(kuò)增效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，Mg<'2+>濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)對該反應(yīng)體系影響較大，Taq酶含量和引物濃度影響較小。最終建立了一套擴(kuò)增效果好、性能穩(wěn)定的性別鑒定反應(yīng)

2、體系。該P(yáng)CR反應(yīng)體系對母牛DNA的擴(kuò)增只有一種產(chǎn)物(255bp)，而對公牛DNA的擴(kuò)增有兩種大小不同的產(chǎn)物(255bp，187bp)。 優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：第一輪擴(kuò)增體積30μl，含外引物0.2μM，Mg<'2+>2.0mM，Taq酶1.5U，dNTPs(2.5mM)1.0μl。然后取第一輪產(chǎn)物1μl作為第二輪擴(kuò)增的模板，同時加入SRY基因引物和內(nèi)標(biāo)基因引物0.2μM，Mg<'2+>2.0mM，Taq酶1.5U，dNTPs(2

3、.5mM)1.0μl，反應(yīng)體積30μl。反應(yīng)條件，預(yù)變性94℃，5min；變性94℃，30s；退火57℃，30s；延伸72℃，1min；最后72℃延伸5min。第一輪20個循環(huán)，第二輪25個循環(huán)。 利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對顆粒細(xì)胞和精子進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證該反應(yīng)體系的靈敏度和特異性。試驗(yàn)結(jié)果表明，該反應(yīng)體系完全適合于對胚胎細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，并且在試驗(yàn)過程中為減少模板丟失，細(xì)胞模板可不經(jīng)提取直接進(jìn)行擴(kuò)增。 另外，還應(yīng)用優(yōu)化后的體

4、系分別以牛、山羊、豬、人以及小鼠的．DNA為模板，同時使用SRY基因引物和內(nèi)標(biāo)基因引物進(jìn)行特異性檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，除了公山羊的DNA樣品在內(nèi)標(biāo)基因引物上有擴(kuò)增產(chǎn)物之外，其余樣品都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明該反應(yīng)體系具有較高的特異性。人的DNA沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，表明可以排除操作人員的污染問題。豬和小鼠的DNA沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明本實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常接觸的豬和小鼠的實(shí)驗(yàn)材料也不會對鑒定結(jié)果產(chǎn)生污染。 本試驗(yàn)對已知性別的87個?；蚪MDNA進(jìn)行了準(zhǔn)確率

5、的測定，鑒定結(jié)果與實(shí)際性別完全相符，準(zhǔn)確率達(dá)100％。試驗(yàn)中共對32枚胚胎進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行一次重復(fù)試驗(yàn)，前后兩次鑒定結(jié)果均一致，說明該體系適合于牛胚胎的性別鑒定。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，操作液中含有血清的胚胎擴(kuò)增時，可以看到洗卵液受到雌性DNA的污染，盡管沒有影響到胚胎性別鑒定的結(jié)果判定，但是還是有一定影響；操作液中不含有血清的胚胎擴(kuò)增時，可以看到洗卵液沒有受到外源DNA的污染，對胚胎性別鑒定的結(jié)果判定沒有任何影響，鑒定結(jié)果一目了然。所以為了克服