利用細(xì)菌array-CGH芯片比較牙齦卟啉單胞菌不同菌株的基因組差異.pdf

1、目的：
　　1.牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis, P.gingivalis）被認(rèn)為是牙周炎最重要的可疑致病菌之一。多項(xiàng)研究證實(shí)，P.gingivalis不同菌株間存在一定的異質(zhì)性，使毒力特性存在差異。而鑒定病原菌的毒力株和毒力基因是研究微生物致病機(jī)制的重要手段。微陣列比較基因組雜交（ array comparative genomic hybridization, array-CGH）技術(shù)具有高分

2、辨率、高通量等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以檢測(cè)基因組DNA拷貝數(shù)的差異，還能精確定位異常片段，便于篩選出毒力致病基因。本研究旨在構(gòu)建 P.gingivalis全基因組規(guī)模的array-CGH芯片平臺(tái)，快速分析不同菌株間基因組的差異，為將來在分子水平上分析 P.gingivalis致病性差異的原因，尋找P. gingivalis致病性相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。
　　2.從不同牙周狀況人群的齦下菌斑中分離出 P.gingivalis，并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。為今

3、后利用array-CGH平臺(tái)，檢測(cè)不同毒力臨床菌株間基因組的差異，從分子水平上闡述牙周炎的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.綜合美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（ National Center For Biotechnology Information, NCBI）上公布的12株P(guān).gingivalis菌的基因組序列信息，設(shè)計(jì)探針序列，定制芯片。提取P.gingivalis高毒力株W83和低毒力株ATCC33277的基因組D

4、NA，先用同一株菌的DNA進(jìn)行自身雜交，以排除所構(gòu)建array-CGH平臺(tái)的技術(shù)噪音，然后利用array-CGH技術(shù)檢測(cè)該兩株菌差異DNA片段，并篩選出部分差異基因，運(yùn)用PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　2.選擇牙周健康者的健康位點(diǎn)，牙周炎患者的炎癥位點(diǎn)和健康位點(diǎn)，記錄探診出血指數(shù)（Bleeding on Probing, BOP），牙周探診深度（Probing Depth, PD），臨床附著喪失（Clinical Attachm

5、ent Loss, CAL）及牙齒松動(dòng)度（Tooth Movement, TM）。刮取齦下菌斑，稀釋后接種于牛腦心浸出液培養(yǎng)（Barin Heart Infusion, BHI）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)分離、傳代、增菌、16s rRNA PCR鑒定后收集菌體，提取DNA備用。
　　1.成功定制包含12株P(guān).gingivalis全基因組序列分析后設(shè)計(jì)的芯片，低毒力株P(guān).gingivalis ATCC33277自身DNA雜交沒有檢出大于2倍的

6、差異點(diǎn)，說明其技術(shù)噪音很低，芯片質(zhì)量合格。
　　2.不同毒力P.gingivalis菌的芯片雜交，不同于自身雜交中均一的黃色信號(hào)，呈現(xiàn)出紅綠混雜的熒光信號(hào)，提示兩株細(xì)菌存在多個(gè)差異基因。
　　3.使用R語言v3.1.1的limma軟件包提取芯片上每條探針的信息，經(jīng)兩菌株之間的比較分析，檢出了多個(gè)基因拷貝數(shù)的不同。其中，P.gingivalis W83的部分特異片段參與編碼毒力致病因子，ATCC33277部分特有片段的編碼蛋白

7、可增強(qiáng)細(xì)菌表明粘附性，使其具有高粘附力。
　　4.經(jīng)基本局部比對(duì)搜索工具（Basic local aligment search tool，BLAST）同源比對(duì)后，得到12個(gè)差異基因，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，證實(shí)與芯片結(jié)果一致。
　　5.在牙周炎患者的齦下菌斑中成功分離得到10株臨床分離株，并進(jìn)行16s rRNA PCR驗(yàn)證，送測(cè)序證實(shí)卻為P.gingivalis。該10株菌的芯片比較基因組雜交分析將由后續(xù)的研究繼續(xù)完成。
　

8、　結(jié)論：
　　1. array-CGH技術(shù)在快速檢測(cè)P.gingivalis基因組DNA拷貝數(shù)的差異，定位異常片段中有明顯的優(yōu)勢(shì)，可用于篩選毒力致病基因。
　　2.本研究成功構(gòu)建了利用 array-CGH技術(shù)檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌不同毒力株基因差異的平臺(tái)，為在分子水平上分析P.gingivalis致病差異的原因奠定基礎(chǔ)。
　　3.已熟練掌握 P.gingivalis的分離鑒定方法，并成功分離培養(yǎng)出10株P(guān).gingival