牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導(dǎo)不同細(xì)胞分泌炎性因子的差異性.pdf

1、慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)是人類常見的口腔感染性疾病之一。牙周炎的發(fā)生發(fā)展受到多種因素的影響。近來研究表明，牙周炎發(fā)生是由于牙周局部免疫防御機制的抑制而使得牙周致病菌定植、繁殖，其產(chǎn)生的多種毒力因子誘導(dǎo)宿主細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子或化學(xué)介質(zhì)，從而導(dǎo)致局部的細(xì)胞毒性和免疫病理變化，造成牙周組織破壞，最終導(dǎo)致牙脫落。除引起牙齒缺失，影響消化系統(tǒng)的功能外，牙周炎還與心血管疾病、早產(chǎn)低體重兒、糖尿病等全身系統(tǒng)

2、性疾病有關(guān)，嚴(yán)重影響了人類生活質(zhì)量。 牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是公認(rèn)的可疑牙周致病菌之一，為產(chǎn)黑色素的革蘭氏陰性厭氧菌。該菌具有一系列逃避宿主免疫防御機制和破壞宿主組織的毒力因子，如脂多糖(lipopolysacharides，LPS)、菌毛(fimbria)、牙齦素(gingipains)等，其中LPS被認(rèn)為是Pg眾多致病物質(zhì)中最為重要的毒力因子。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的主

3、要成分，是一個關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)。LPS作為一個潛在的細(xì)胞激活因子，可激活牙周組織中的多種靶細(xì)胞，包括免疫反應(yīng)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)、具有防御作用的中性粒細(xì)胞、牙周細(xì)胞的主體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，促使其合成、分泌各種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，參與牙周組織創(chuàng)傷。其中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8是具代表性的炎性細(xì)胞因子。牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)與典型的細(xì)菌內(nèi)毒素大腸桿菌脂多糖(E.coli-LPS,E

4、-LPS)的化學(xué)結(jié)構(gòu)基本相似，僅生物活性部分脂質(zhì)A磷酸化和酰基化形式有所不同。然而，LPS盡管結(jié)構(gòu)上高度保守，但不同細(xì)菌來源的脂多糖仍具有重要的結(jié)構(gòu)差異，可顯著改變宿主反應(yīng)。有研究報道Pg-LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的活性弱于E-LPS，且對不同靶細(xì)胞致炎作用存在很大的差異性。眾所周知，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是牙周組織的主要細(xì)胞。作為牙齦結(jié)締組織的主要成分的人成纖維細(xì)胞，在牙周病中起重要作用，可能與細(xì)菌和包括LPS在內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)物直接相互作用。越來

5、越多的證據(jù)表明上皮細(xì)胞不僅僅是一種機械屏障，同時也是一種先天免疫系統(tǒng)。目前的研究表明Pg感染人口腔上皮細(xì)胞后能檢測到相應(yīng)的細(xì)胞因子。單核．巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)細(xì)菌的局部炎癥應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。 根據(jù)以往相關(guān)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Pg刺激牙周組織細(xì)胞、免疫反應(yīng)細(xì)胞等能產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，但對Pg-LPS刺激上述細(xì)胞后分泌炎性細(xì)胞因子的變化過程卻知之甚少。CP病變過程分靜止期和活動期，并已肯定與牙周炎癥急性發(fā)作和

6、慢性發(fā)展直接相關(guān)。為此有必要對此進行進一步的探討，為今后深入研究牙周病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)防治療做一些必要的鋪墊。 目的： 采用改良的熱酚-水法從Pg ATCC 33277株中提取Pg-LPS，并獲得純化后的精制品。用鱟試驗、紅外光譜初步探討Pg-LPS的生物活性和化學(xué)基本結(jié)構(gòu)。探討Pg-LPS誘導(dǎo)人口腔上皮細(xì)胞(KB細(xì)胞)、人牙齦成纖維細(xì)胞(HGF-1細(xì)胞)及人單核．巨噬樣細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α、I

7、L-1β、IL-6和I-8的能力及其差異。 方法： 1、采用改良的熱酚-水法從Pg ATCC 33277株中提取Pg-LPS，并獲得純化后的精制品。采用鱟試驗和紅外光譜對提取的Pg-LPS進行鑒定。 2、用不同濃度的Pg-LPS刺激①KB細(xì)胞；②HGF．1細(xì)胞：③THP-1.細(xì)胞三種不同細(xì)胞持續(xù)不同時間后提取上清，采用EI,ISA試劑盒定量檢測①TNF-~：②IL．1D；③IL-6；④IL．8四種不同細(xì)胞因子水平

8、的變化。實驗中采用商品化大腸桿菌Olll：B4脂多糖(E-I,PS)作為對照。 結(jié)果： 1、Pg-PS產(chǎn)量：Pg-IPS提純品產(chǎn)量為1.3 mg濕菌(W/W)。 2、：Pg-LPS和E-LPS凝固鱟試劑所需最低濃度均為15ng/ml，其紅外光譜也極為相似。 3、Pg-S或E-LPS誘導(dǎo)HGF-1細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1β水平呈峰形增高(P<0.01)，但THP．1細(xì)胞為持續(xù)性升高(P<0.01)。

9、 4、Pg-LPS或E-LPS誘導(dǎo)HGF-1或THP-細(xì)胞分泌的IL-6水平呈持續(xù)性增強(P<0.01)。 5、Pg-LPS和E-LPS均可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞增強IL-8的分泌(P<0.01)，但對HGF-1細(xì)胞僅Pg-LPS有促IL-8分泌的效應(yīng)(P<0.01)。 6、Pg-LPS和E-LPS均不能誘導(dǎo)KB細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子。 結(jié)論： 1、采用改良的熱酚一水法提取的Pg-LPS產(chǎn)量較高。