α1-抗胰蛋白酶的分離純化、理化性質(zhì)與活性測(cè)定方法的研究.pdf

1、al-抗胰蛋白酶(Alpha-1 Antiaypsin，以下都簡(jiǎn)稱(chēng)ocl-AT，)，在體內(nèi)主要由肝臟合成。在電泳中，其遷移位點(diǎn)位于al蛋白帶，因而又被稱(chēng)為al-蛋白酶抑制劑(Alpha-1 Proteinase Inhibitor，al-PI)。a1-AT是體內(nèi)最重要的蛋白酶抑制物，主要抑制胰蛋白酶和彈性蛋白酶的活性，作為血液制劑，al-AT主要用于因遺傳性a1-AT缺乏而引起的肺氣腫患者的終身替補(bǔ)治療以及肺部炎癥疾病的防治，在臨床上有

2、比較廣泛的應(yīng)用前景。 本文根據(jù)豬血漿中al-AT與人al-AT理化性質(zhì)的相似性，參考人al-AT的制備方法，從豬血漿中提取純度較高的al-AT。主要方法為鹽析、離子交換層析、親和層析和凝膠過(guò)濾層析，經(jīng)過(guò)這四步后，活性和純度大大得到提高，酶活性回收率為11.0％，純化倍數(shù)達(dá)到25.6倍。 對(duì)離子交換層析，親和層析和凝膠過(guò)濾層析的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳分離條件，最大程度的保留了目的蛋白活性，獲得了較高的回收率

3、。離子交換層析所選擇的條件為：平衡緩沖液為0.05mol/L，pH6.4 PBS；上樣濃度2.0mg/mL，上樣50mL，上樣流速為1.0ml/min；洗脫液為0.05mol/L，pH6.4，含0.5：mol/LNaClPBS，洗脫流速2.0m1/min，采用一步洗脫的方式洗脫。親和層析所選擇的條件為：上樣濃度1.0 mg/mL，上樣10mL，上樣流速為0.5mg/mL；洗脫液為0.05mol/L，pH7.6，含0.5 mol/LNaC

4、l，0.2mol/L a-甲基-D-葡萄糖苷Tris-HCI緩沖液，洗脫流速1.0m1/min，采用一步洗脫的方式洗脫。凝膠過(guò)濾層析所選擇的條件為：上樣濃度為10mg/mL，上樣5mL，洗脫液為0.05mol/L，pH7.6 Tris-HCl緩沖液，洗脫流速為0.5m1/min。 接下來(lái)本文對(duì)豬a1-AT的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，主要有al-AT的紫外吸收，分子量，糖含量，等電點(diǎn)和氨基酸組成，并制備了抗血清。對(duì)a1-AT光吸收

5、波譜掃描，得出豬a1-AT的紫外吸收峰在260-300nm之間，其中波谷在260nm，波峰在280nm；SDS-PAGE電泳檢測(cè)了每步的純度并測(cè)定了a1-AT分子量，得出a1-AT分子量為52.98KDa；SDS-PAGE電泳后的凝膠用過(guò)碘酸-schiff試劑染色，表明a1-AT為糖蛋白；進(jìn)一步用苯酚一硫酸法測(cè)定其含糖量為12.20％；等電聚p焦電泳法測(cè)αl-AT的等電點(diǎn)，得出其等電點(diǎn)為4.0、4.2、4.5，較明顯的為4.2這條帶；高

6、效液相法分析待測(cè)α-AT與標(biāo)準(zhǔn)人αl-AT的氨基酸組分，由于待測(cè)αl-AT與標(biāo)準(zhǔn)人αl-AT純度不夠高，因此測(cè)得結(jié)果部分氨基酸的含量相差較大，無(wú)法進(jìn)行比較；純化出的豬αl-ART免疫兔子，制備出兔抗豬抗血清，經(jīng)瓊脂糖免疫雙擴(kuò)散檢測(cè)出其抗血清的效價(jià)為1∶16。 影響αl-AT活性的因素主要有溫度、pH和保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。Αl-AT活性能保持較高水平的條件是溫度在4—40℃；pH值在6.0-10.0；αl-AT應(yīng)保存在低溫下，偏

7、堿的緩沖液中，分裝保存，減少凍融次數(shù)。長(zhǎng)期不用，-20℃保存較好，活性下降較小。 另外，本文還對(duì)αl-AT抑制胰蛋白酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。確定了合適的反應(yīng)時(shí)間為10min，BAPNA溶液濃度為0.2mg/mL，胰蛋白酶的濃度為4．0mg/mL；米氏Km=3.42 mg/mL，最大反應(yīng)速度V<,max>=0.048 mg/(min-mL)。 通過(guò)對(duì)豬αl-AT和人αl-AT理化性質(zhì)的比較，得出大部分性質(zhì)是一致的，其小部