親和層析法純化胰蛋白酶

1、親和層析法純化胰蛋白酶 第一部分 實驗內(nèi)容簡介,1 內(nèi)容摘要 親和層析包括了一整套復雜的底物及其配體與生物大分子之間相互作用時所形成的獨特的生物學特性。在親和結(jié)合的過程中涉及到疏水力、靜電力、范德華力及空間阻力等因素的影響。 親和層析的概念可以理解為配基以共價鍵的形式與水不溶性固體載體共價結(jié)合， 形成具有高度專一性的親和吸附劑。以該介質(zhì)為填料填充親和層析柱，從復雜的混合物中有針對性分離某一種成分。,本實

2、驗以親和層析方法分離純化豬胰蛋白酶為目的，從豬胰臟提取液中分離純化胰蛋白酶，最終得到純度較高的胰蛋白酶。圍繞親和層析實驗所涉及的蛋白質(zhì)和酶基本性質(zhì)及相關(guān)技術(shù)進行綜合訓練。其中主要包括親和層析介質(zhì)配基的制備，親和介質(zhì)的合成，蛋白質(zhì)和酶的分離純化，酶活性的測定等內(nèi)容。 通過綜合訓練，能夠系統(tǒng)掌握蛋白質(zhì)制備的基本原理和操作，學習如何進行實驗設(shè)計，掌握實驗過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對實驗中出現(xiàn)的問題進行科學的分析。使學生在學習實驗技術(shù)的同時，

3、自覺培養(yǎng)分析問題和解決問題能力。,2實驗目的方法 掌握蛋白質(zhì)分離純化的基本原理與操作技術(shù) 掌握親和層析的基本原理及親和介質(zhì)合成技術(shù) 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定的原理和方法 掌握消光系數(shù)法測定蛋白質(zhì)的原理及計算方法,1. 3實驗流程  雞蛋清 Spharose 4B 豬胰臟 ↓

4、 ↓ ↓ 提取 ↓ 活化 提取 分離純化

5、 ↓ ↓ ↓ 純卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液 ↓ ↓

6、 偶聯(lián) 激活 ↓ ↓ CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液

7、 ↓ 親和層析 ↓

8、 酶促動力學 ← 純胰蛋白酶 → 酶活性測定 ↓

9、 酶蛋白含量測定,1. 4要求掌握的技術(shù) 柱層析技術(shù) Sephadex G-25 分子篩層析 DEAE-Cellulose 離子交換層析 CHOM –Sepharose 4B 親和層析 蛋白質(zhì)提取技術(shù)

10、 10%TCA 提取雞卵粘蛋白 3.5%乙酸,pH 3.0提取胰蛋白酶原 蛋白含量測定技術(shù) 消光系數(shù)法測定胰蛋白酶含量 消光系數(shù)法測定雞卵粘蛋白含量,生物活性測定 胰蛋白酶比活性測定 雞卵粘

11、蛋白抑制活性測定   親和介質(zhì)合成技術(shù) 載體-Sepharose 4B的前處理 載體 -Sepharose 4B的活化 活化載體-Sepharose 4B的偶聯(lián),第二部分 實驗方法 實驗一 雞卵粘蛋白的分離純化

12、 1雞卵粘蛋白的基本性質(zhì) 1.1雞卵粘蛋白的組成 分子量: 28000Da 分子組成: 四個分子量相近的亞基組成糖蛋白 糖基部分: D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸,1.2化學穩(wěn)定性 耐熱: 在80℃條件下,理化性質(zhì)不發(fā)生改變 耐有機溶劑: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度 耐沉淀劑: 在10%的TCA的溶液中不發(fā)生沉淀.

13、 1.3等電點性質(zhì) 等電點: pI在3.9-4.5之間 溶液中的狀態(tài): 在pH3.0的溶液中穩(wěn)定, 在pH8.0的溶液中容易分解 雞卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解狀態(tài)見表1。,表1，雞卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度,,,1. 2.雞卵粘蛋白的提取 2.1提?。?每組發(fā)給50毫升的雞卵清加入一定體積的10% pH1.15 TCA溶液(輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入),攪勻后用pH試紙檢查pH值

14、,待pH穩(wěn)定在3.5± 0.2后放置4℃冰箱過夜. 2.2離心： 轉(zhuǎn)移50毫升離心杯中,于3000rpm 離心15min。 2.3過濾： 傾出上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質(zhì)和不溶物 2.4調(diào)pH值： 用1mol/L HCl 將溶液精確調(diào)至pH3.5。量取體積。,2.5丙酮沉淀：緩緩加入三倍體積預冷的丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴，放置冰箱內(nèi)靜止4小時。 2.

15、6離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000 rpm離心15min。 2.7除殘留丙酮：棄去上清液，將盛有沉淀的離心杯至于真空干燥器中。抽去殘留丙酮。（沉淀物的顏色由白變成透明膠狀物即可） 2.8溶解：加入25ml蒸餾水或20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液溶解，濾紙過濾，收集濾液，備用。,3雞卵粘蛋白的分離純化 3.1 Sephadex G-25 柱脫鹽 (1)溶脹： 稱取15g S

16、ephadex G-25放入500ml的燒杯中, 加入200ml 蒸餾水，在室溫下溶脹24小時或在沸水浴中溶脹2小時。 (2)裝柱： 取一支30×3cm 的層析柱，將溶脹好的Sephadex G-25裝柱，自然沉降。 (3) 處理： 用2倍柱床體積的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍體積的蒸餾水洗去殘留的NaCl。,(4)平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，

17、流速控制在1.0-1.5 ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。 (5)上樣： 將柱內(nèi)的緩沖液液面流至于膠面相切，取20ml雞卵粘蛋白提取液上樣，待樣液液面流至于膠面相切，加入2-3ml緩沖液沖洗層析柱內(nèi)壁，待溶液液面流至于膠面相切，然后加入緩沖液距膠面高度約2-3cm，以同樣的流速洗脫。 (6)收集： 在檢測儀上觀察到開始出現(xiàn)峰時進行收集。見圖1,圖1 Sephadex G-25分子

18、篩層析分離圖譜,,3.2 Cellulose離子交換柱層析分離 (1)溶脹： 稱取20g DEAE-Cellulose放入500ml的燒杯中, 加入150ml 蒸餾水，在室溫下溶脹24小時。(2)裝柱： 取一支20×3cm 的層析柱，將溶脹好的DEAE-Cellulose裝柱，自然沉降。 (3) 再生： 用200ml 0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH 混合溶液洗

19、柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達到pH8.0。用200ml 0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達到pH6.0。,(4) 平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。 (5)上樣： 將經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽的卵粘蛋白溶液上樣，用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，直到儀器繪出

20、穩(wěn)定的基線。流速控制在1.0ml/min左右。 (6)洗脫： 用0.3mol/L NaCl - 20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液。 (7)收集： 在檢測儀上觀察到出現(xiàn)高峰時開始收集。見圖2,圖2，雞卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分離,,3.3透析及丙酮沉淀 (1) 透析： 將經(jīng)DEAE-Cellulose柱分離的雞卵粘蛋白轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，對蒸餾水透析，隔一段時間換一次水，直到滲出

21、液經(jīng)BaCl2溶液檢查無氯離子存在，即可。 (2) 調(diào)pH值： 將透析好的雞卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精確調(diào)至pH4.0（最好一次調(diào)成功），量體積。 (3)丙酮沉淀： 加入3倍體積的預冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴，在冰箱內(nèi)靜止4小時以上或過夜。,(4)離心： 虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000 rpm離心15min，收集沉淀。 (5) 干燥：

22、 將盛有雞卵粘蛋白的離心杯放入真空干燥器中干燥。 (6) 收集雞卵粘蛋白成品，冰箱保存。,4活性測定 (1)標準胰蛋白酶活性測定 空白: 1.5ml緩沖液→1.5ml底物混勻. 樣品: 1.5ml緩沖液→1.5ml底物→胰蛋白酶10μl混勻,立即測定 (2)自提雞卵粘蛋白抑制活性測定 空白: 1.5ml緩沖液→1.5ml底物混勻. 樣品: 1.5ml緩沖液→雞卵粘蛋白10μl→胰蛋白酶1

23、0μl混勻放置2min以上→1.5ml底物,立即測定,(3) 雞卵粘蛋白含量測定 取透析液0.3ml稀釋10倍, 測定 A280. 3實驗結(jié)果 (1)計算雞卵粘蛋白收率 (2)計算標準胰蛋白酶的比活性 (3) 計算雞卵粘蛋白的抑制活性。,5 試劑配制 5.1公用試劑 (1) 10%TCA溶液 , pH1.15 , 1500ml (50ml/組) (2) 0.05mol/L ,pH8.

24、0 Tris-HCl緩沖液, (內(nèi)含0.2% CaCl2) 200ml (3) 2mmol/L BAEE底物溶液 200ml (4) 1mg/L Trypsin標準溶液 10ml,5. 2自配試劑 (1) 0.2mol, pH6.6, PBS緩沖液 120ml (×10) (2) 0.3mol/L NaCl – 0.02mol/L , pH6.6, PBS緩沖液 100ml

25、(3) 0.5mol/L HCl溶液 200ml (4) 0.5mol/L NaCl – 0.5mol/L NaOH溶液 200ml (5) 0.5mol/L NaCl 溶液 250ml,6時間安排,,,實驗二 親和層析純化胰蛋白酶,1 原理 雞卵粘蛋白(ovomucoid, 簡稱CHOM)，是胰蛋白酶的天然抑制劑，在pH7.8- 8.0的緩沖溶液中二者發(fā)生專一性的親和作用。以雞卵粘蛋白為配基，偶聯(lián)在已經(jīng)活化

26、的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)-Sepharose 4B上，制備成雞卵粘蛋白親和層析介質(zhì)（CHOM- Sepharose 4B）。然后通過親和層析法從胰蛋白酶粗提液中分離純化胰蛋白酶。常用的載體活化與蛋配基偶聯(lián)的方法有環(huán)氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反應的基本原理如下圖所示：,1.1環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián) ↓活化,,,↓偶聯(lián) ↓親和結(jié)合,,↓洗脫,,1.2溴化氰活化載體 與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián),2親和介質(zhì)合成2.1瓊脂

27、糖凝膠層析介質(zhì)(Sepharose 4B)的活化2.1.1 瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)的處理稱取10克瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)，置于G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸餾水抽洗，抽干后轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中備用。,2.1.2配方 瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)--QT410克 蒸餾水7ml 1,4二氧六環(huán)8 ml 2 mol/L NaOH 6.5ml 環(huán)氧氯丙烷1.5ml。,

28、2.1.3活化 將配制的好介質(zhì)的三角瓶，放入45℃恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)/分鐘，振搖活化2小時。停止活化，轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，抽去活化劑，用100ml蒸餾水洗（少量多次），轉(zhuǎn)移100ml到三角瓶中，準備偶聯(lián)。,2.2偶聯(lián) 稱取約100mg雞卵粘蛋白，用10ml 0.1mol/L pH9.5 Na2CO3緩沖液充分溶解。取0.1ml稀釋10倍測定OD280，計算溶液的蛋白濃度。然后將溶解好的雞卵粘蛋白溶液，轉(zhuǎn)移到100ml三

29、角瓶中與活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)混勻。在40℃恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)/分鐘，振搖偶聯(lián)22小時左右，停止偶聯(lián)。,2.3洗滌 取一個洗凈的500ml抽濾瓶，將已經(jīng)偶聯(lián)好的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)抽濾，收集濾液，測定濾液中剩余的雞卵粘蛋白的含量。 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml 蒸餾水抽洗，再用20ml 親和層析洗脫液洗滌。 將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到50ml的小燒杯內(nèi)，加入20ml 親和層析

30、平衡液，浸泡20分鐘，脫氣，裝柱。,3胰蛋白酶粗提液的制備3.1胰蛋白酶的基本性質(zhì)3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于動物的胰臟或其他組織中。在底物的誘導下或激活劑的作用下，酶原的C端水解，去6肽轉(zhuǎn)變成具有活性的胰蛋白酶。 - 6 肽 胰蛋白酶原 胰蛋白酶

31、 Ca+2 激活劑,,3.1.2等電點與分子量：胰蛋白酶原的 pI=10.8 ， 分子量：24000Da胰蛋白酶的 pI=8.9 ， 分子量：23700Da,3.1.3 穩(wěn)定性 胰蛋白酶在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中容易自溶，在提取的過程中要注意溶液的pH值。 當溶液的 pH ? 2.0 容易變性 pH = 3.0 生物活性穩(wěn)定

32、pH ? 7.0 容易自溶,3.2胰蛋白酶原的提取(1)勻槳: 取約30克豬胰臟，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重20-25克左右,剪成碎塊。轉(zhuǎn)移到組織搗碎器內(nèi),加入150ml 預冷的3.5%的乙酸酸化水,勻槳.(2)提取: 轉(zhuǎn)移到500ml燒杯中,用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值在3.5-4.0之間,10℃攪拌提取約4小時.(3)過濾: 取一塊紗布,折疊成四層,用水潤濕,放在玻璃漏斗上,將胰蛋白酶原提取液過濾,收集濾液

33、.,(4)酸化: 用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)濾液的pH值至2.5-3.0之間,4℃冰箱靜止沉淀4小時以上。(5)過濾: 折疊濾紙過濾,收濾液。,3.3胰蛋白酶原的激活(1)調(diào)節(jié)pH值: 用5mol/L NaOH 將濾液精確調(diào)節(jié)pH值至pH8.0,量取溶液體積.(2)加激活劑: 加入固體CaCl2使溶液的Ca+2 終濃度達到0.1mol/L,然后加入約5mg 結(jié)晶胰蛋白酶,混勻,激活.(3)激活時間:

34、 在4℃冰箱內(nèi)激活12-16小時, 在25℃恒溫水浴中激活2-4小時.,3.4停止激活(1)活性測定:取1ml上清液分別測定蛋白濃度和活性.具體操作見活性測定部分.(2)停止激活:等酶溶液的比活性達到1000u/mg左右, 用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值到3.0.(3)過濾: 濾紙過濾,濾去CaSO4沉淀,收集濾液, 4℃冰箱保存.,4親和層析分離胰蛋白酶(1)裝柱:取一支層析柱(10×1.0cm),將合成好的親

35、和層析介質(zhì)CHOM-Sepharose 4B 裝入柱內(nèi),自然沉降. (2)平衡:以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內(nèi)含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡.(3)上樣:將以經(jīng)激活的胰蛋白酶提取液, 用5mol/L NaOH 精確調(diào)節(jié)pH值至pH8.0, 濾紙過濾,取濾液上樣.通過親和介質(zhì)的偶聯(lián)量和胰蛋白酶粗提液的比活性,計算出上樣所需體積.計算方法如下:,偶聯(lián)mg數(shù)×0.8

36、6×1.3×104(u/mg)上樣體積(ml)= 粗酶濃度(mg/ml)×比活(u/mg),,(4)平衡: 上完樣以后, 以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內(nèi)含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡,洗去未被吸附的雜蛋白。(5)洗脫: 等平衡到基線穩(wěn)定后,用0.1mol/L,pH2

37、.5甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脫.收集洗脫峰。,,(6)親和層析洗脫曲線:,,胰蛋白酶活性測定1胰蛋白酶活性測定1.1胰蛋白酶測定的基本原理 胰蛋白酶是一種蛋白水解酶,它除了能水解堿性氨基酸與其它氨基酸形成的肽鍵外,還能水解堿性氨基酸所形成的酯鍵,催化活性具有高度的專一性.因此,可以用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N- benzoyl-L-argine ethyl ester,簡稱BAEE)為底物測定胰蛋白酶

38、活性. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在堿性條件下,經(jīng)胰蛋白酶作用水解去一個乙基生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA), 催化反應原理如圖所示。,由于BAEE在波長253nm處的光吸收值遠遠弱于BA。因此，可以在加入酶為零點,測定在X分鐘內(nèi)的遞增吸光值.通過酶的定義求出酶活性。,1.2測定胰蛋白酶活性的定義底物濃度 C =1mmol/L光程:L=1cm波長: λ=253nm

39、 1個BAEE單位溫度: T=25℃體積: V=3ml遞增值: ΔO.D =0.001A,,,1.3計算公式(1)活性單位 ΔO.DBAEE單位(u/ml) = × N(稀釋倍數(shù)) 0.001 (2)比活性

40、 測得的BAEE 活性單位(u/ml)BAEE單位(u/mg) = 胰蛋白酶濃度mg/ml)×加入體積(ml),,,2雞卵粘蛋白活性的測定 雞卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制劑,通常1μg雞卵粘蛋白能抑制0.86μg胰蛋白酶的活性(相

41、當于1 : 0.86).在胰蛋白酶液中加入適量的雞卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就會降低,胰蛋白酶遞減的活性就是雞卵粘蛋白的抑制活性.在同樣的條件下分別測定出未加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A1和加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A2. 將A1 - A2就可以得到雞卵粘蛋白的抑制活性.計算公式如下:,(1)抑制活性 A1 – A2BAEE單位(Iu/ml) =

42、 × N(稀釋倍數(shù)) 0.001A1 ：胰蛋白酶活性A2：加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性(2)抑制比活 測得的BAEE 活性單位(Iu/ml)BAEE單位( Iu/mg) =

43、 雞卵粘蛋白濃度(mg/ml)×加入體積(ml),,,3蛋白質(zhì)含量測定3.1消光系數(shù)的定義：在蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸的數(shù)量以及分子的緊密程度有差異，在280nm處的光吸收強弱不同。在一定的條件下，一種純的蛋白質(zhì)在在280nm處的光吸收值是一個常數(shù)。因此酶以純的蛋白質(zhì)在280nm處都有一個

44、的消光系數(shù)A280。用符號表示為E1%1cm。這個符號的定義是指在濃度為1%（W/V）的蛋白質(zhì)溶液中，測定光程為1cm 的條件下，該蛋白的吸光值。,如:胰蛋白酶的E1%1cm是13.5，是指胰蛋白酶的濃度為1%(g/100ml)，光程為1cm時光吸收值A(chǔ)280 = 13.5。當胰蛋白酶的濃度0.1g%(100mg/100ml)時，光程為1cm，光吸收值A(chǔ)280是1.35。當 雞卵粘蛋白的濃度1% (g/100ml)時，A280是4.

45、13，濃度100%(mg/100ml)時，A280是0.413。在計算時大多數(shù)使用的蛋白濃度都是100mg/100ml，即濃度為1mg/1ml。計算出來的蛋白濃度單位可以用mg/ml表示。,3.2計算公式 A280×稀釋倍數(shù)雞卵粘蛋白濃度(mg/ml) =

46、 0.413   A280×稀釋倍數(shù)胰蛋白酶濃度(mg/ml) = 1.35,,,4實驗結(jié)果4.1實驗數(shù)據(jù)4.1.1雞卵粘蛋白產(chǎn)率(mg/100ml蛋清)4.

47、1.2親和介質(zhì)偶聯(lián)率( mg/ml介質(zhì))4.1.3胰蛋白酶活性回收率(純酶總活性/粗酶總活性)4.1.4親和介質(zhì)吸附率(mg/ml介質(zhì))4.1.5純化倍數(shù)(純酶比活/粗酶比活)4.2實驗圖表4.2.1Sephadex G-25 層析曲線4.2.2Cellulose 層析曲線4.2.3親和層析洗脫曲線4.2.4胰蛋白酶活性曲線積及卵粘蛋白抑制曲線,試劑配制 1公用試劑 (1) 10%TCA溶液 , pH1.15 ,

48、 1500ml (50ml/組) (2) 0.05mol/L ,pH8.0 Tris-HCl緩沖液, (內(nèi)含0.2% CaCl2) 200ml (3) 2mmol/L BAEE底物溶液 200ml (4) 1mmol/L Trypsin標準溶液 10ml (5) 2mol/L NaOH溶液 300ml (6.5ml/組),1. 2自配試劑 (1) 5mol/L NaOH 溶液 20ml

49、(2) 2mol/L H2SO4 溶液 20ml(3) 0.3mol/L NaCl – 0.02mol/L , pH6.6, PBS緩沖液 100ml (4) 3.5%, pH3.0 HAC溶液 200ml(5) 0.1mol/L, pH8.0 Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.5mol/L KCl 0.2% CaCl2 ) 200ml(6) 0.1mol/L pH2.5 甲酸溶液(內(nèi)含0.5mol/L KCl) 100ml