ALA和PHBA緩解黃瓜高溫脅迫時以及轉(zhuǎn)fhy3基因擬南芥中基因組DNA甲基化變化.pdf

1、隨著溫室效應(yīng)的影響，高溫天氣的出現(xiàn)愈加頻繁。高溫是蔬菜栽培過程中常見的逆境因子，嚴重影響蔬菜的產(chǎn)量。黃瓜也稱胡瓜、青瓜，屬葫蘆科植物，是我國主要栽培蔬菜之一，是一種喜溫而不耐高溫的蔬菜。因此，黃瓜耐熱性研究具有重要的意義。
　　 本實驗報告了外源5-氨基乙酰丙酸(ALA)和對羥基苯甲酸(PHBA)緩解黃瓜幼苗高溫脅迫的機制，研究了外源ALA和PHBA對高溫脅迫下黃瓜幼苗生長量、抗氧化酶的活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量和DNA甲基

2、化的影響，分離了高溫脅迫下外源ALA和PHBA誘導(dǎo)的甲基化差異片段，然后對這些差異片段進行克隆、測序和序列的生物信息學(xué)分析。
　　 本實驗從抗氧化酶和整個基因組水平上初步揭示ALA和PHBA緩解高溫脅迫的機制，為利用甲基化差異基因打下基礎(chǔ)，并為其它外源物質(zhì)緩解植物逆境脅迫的機制研究提供參考。
　　 轉(zhuǎn)基因食品安全性是人們討論的焦點。在轉(zhuǎn)基因植物中，內(nèi)部和外部的環(huán)境因素會對未轉(zhuǎn)化的外源基因的甲基化程度產(chǎn)生影響，從而影響基因

3、的表型。外源基因的轉(zhuǎn)入會導(dǎo)致與外源基因同源的內(nèi)源基因沉默，并且轉(zhuǎn)入外源基因會為宿主植物基因組帶來不可預(yù)期的影響。
　　 本實驗通過對轉(zhuǎn)fhy3基因擬南芥DNA甲基化的研究，分離了野生型、突變體和轉(zhuǎn)fhy3基因擬南芥的甲基化差異片段，然后對這些差異片段進行克隆、測序和序列的生物信息學(xué)分析，并對與擬南芥基因組相似性高的三個基因進行實時熒光定量分析，并通過亞硫酸鹽測序來驗證MSAP結(jié)果。我們的目的是研究轉(zhuǎn)入外源基因是否會影響轉(zhuǎn)基因植物

4、基因組中與其不同源基因的DNA甲基化的變化。我們的研究也為了解轉(zhuǎn)入外源基因?qū)D(zhuǎn)基因植物帶來的影響打下基礎(chǔ)。
　　 待黃瓜幼苗長至兩葉一心時，分別用3μMALA和0.5mM PHBA于常溫(25/18℃)條件下處理黃瓜幼苗2d，然后轉(zhuǎn)入高溫(42/38℃)環(huán)境中處理。高溫脅迫結(jié)束后取第二片真葉，測定其抗氧化酶活性和抗氧化物的含量。同時，實驗還提取了黃瓜葉片的基因組DNA，并利用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)研究黃瓜葉片基因組

5、DNA甲基化的水平和狀態(tài)變化，分別對高溫脅迫下ALA和PHBA預(yù)處理誘導(dǎo)的DNA甲基化差異片段進行回收、克隆和測序分析，并通過實時熒光定量測定了差異基因在黃瓜不同組織的表達水平，利用亞硫酸鹽測序來驗證MSAP的準確性。
　　 擬南芥野生型、fhy3突變體和GUS-FHY3（轉(zhuǎn)fhy3基因擬南芥）的種子在22℃條件下萌發(fā)和成長，收集擬南芥的根、節(jié)間、花和蓮座葉保存于液氮中，用于提取擬南芥的基因組DNA和總RNA，利用MSAP技術(shù)研

6、究擬南芥基因組DNA甲基化的水平和狀態(tài)變化，對差異片段進行回收、克隆和測序分析，并通過實時熒光定量測定了差異基因在擬南芥不同組織的表達水平，利用亞硫酸鹽測序來驗證MSAP的準確性。主要結(jié)果如下:
　　 (1)高溫脅迫下外源ALA和PHBA對黃瓜幼苗生長的影響
　　 高溫脅迫使黃瓜幼苗生長指標均顯著下降，葉片萎蔫;而經(jīng)過ALA或PHBA預(yù)處理再進行高溫脅迫的黃瓜幼苗，生長指標明顯升高，葉片萎蔫率下降。高溫脅迫嚴重抑制了黃瓜

7、幼苗的生長，ALA和PHBA處理均緩解了高溫脅迫對黃瓜生長的抑制作用。
　　 (2)高溫脅迫下外源ALA和PHBA對黃瓜葉片抗氧化酶及相關(guān)指標的影響
　　 在外源ALA或PHBA預(yù)處理實驗中，高溫脅迫使幼苗葉片的MDA和ROS含量高于對照組。與高溫脅迫相比，利用外源ALA或PHBA預(yù)處理后再進行高溫脅迫時增強了黃瓜葉片抗氧化酶SOD、CAT、GPX、GSHPx、APX、MDHAR、DHAR和GR的活性，因而降低了葉片的M

8、DA含量和ROS含量。由此可知，外源ALA和PHBA預(yù)處理都提高了黃瓜葉片抗氧化酶的活性，減少了活性氧含量，進而減輕了高溫脅迫對黃瓜幼苗的傷害。
　　 (3)高溫脅迫下外源ALA和PHBA對黃瓜葉片DNA甲基化的影響
　　 本實驗對黃瓜葉片基因組DNA進行了MSAP分析，兩個實驗中甲基化敏感擴增位點多態(tài)位點占總擴增位點數(shù)的比例均在19％-21％之間。高溫和ALA或PHBA預(yù)處理均導(dǎo)致了黃瓜基因組DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生改變。

9、通過克隆所得的差異片段均與黃瓜基因組具有高度相似性，并利用實時熒光定量技術(shù)測定差異基因在黃瓜不同組織的表達水平和亞硫酸鹽測序的方法驗證差異片段。
　　 (4)轉(zhuǎn)fhy3基因擬南芥或fhy3突變體對擬南芥葉片DNA甲基化的影響
　　 本實驗對擬南芥葉片基因組DNA進行了MSAP分析，實驗中甲基化敏感擴增位點多態(tài)位點占總擴增位點數(shù)的比例均在10％-12％之間。fhy3突變體和轉(zhuǎn)fhy3基因均導(dǎo)致了擬南芥基因組DNA甲基化狀態(tài)