酒依賴患者全基因組DNA甲基化模式研究.pdf

1、目的:
　　1.利用全基因組DNA甲基化芯片（The Illumina InfiniumHuman Methylation450），檢測(cè)酒依賴（alcohol dependence，AD）患者及其未患病同胞全基因組水平DNA甲基化程度，篩選出兩者之間甲基化程度具有差異的位點(diǎn)，探討這些差異性位點(diǎn)所在基因甲基化狀態(tài)和酒依賴之間的關(guān)聯(lián)。利用焦硫酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)某些甲基化程度差異性位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證分析，比較芯片結(jié)果與焦硫酸測(cè)序結(jié)果的相關(guān)性，增加

2、可信度。
　　2.采用病例對(duì)照放大樣本量分析高差異程度基因，初步了解表觀遺傳在酒依賴病理機(jī)制中的作用和意義。
　　對(duì)象與方法:
　　1.以精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版(Diagnosticand Statistical Manual of mental disorder-Ⅳ，DSM-Ⅳ)軸Ⅰ障礙定式臨床檢查(Structured Clinical Interview for DSM-Ⅳ AxisⅠ Disorders,

3、SCID-Ⅰ)為診斷標(biāo)準(zhǔn)，將診斷為酒依賴者招募為病例組，并以酒精依賴性疾患識(shí)別測(cè)驗(yàn)量表(The Alcohol Use Disorders Identification Test，AUDIT)評(píng)定病例組酒依賴嚴(yán)重程度，應(yīng)用生活事件量表(LES)、Wheatley應(yīng)激量表了解負(fù)性生活事件及出現(xiàn)酒依賴的可能應(yīng)激因素;以與病例組年齡、文化程度、地域相匹配的原則招募健康對(duì)照組;同時(shí)，在知情同意的基礎(chǔ)上，選取酒依賴者家庭中一個(gè)尚未出現(xiàn)酒依賴（患病

4、）狀態(tài)的同胞納入未患病同胞對(duì)組。本課題共招募兩組研究對(duì)象。一組是AD及未患病同胞對(duì)10對(duì)，均為男性。另一組是病例組（63例）和健康對(duì)照組（65例），均為男性。所有入組研究對(duì)象均來自新鄉(xiāng)市市區(qū)及縣區(qū)。
　　2.抽取所有研究對(duì)象外周靜脈抗凝血8～10ml，利用DNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)）提取各樣本基因組DNA，并對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸轉(zhuǎn)化處理及PCR擴(kuò)增。利用全基因組甲基化芯片(The Illumina Infinium

5、Human Methylation450)對(duì)10對(duì)AD同胞對(duì)進(jìn)行基因組DNA甲基化檢測(cè)分析并得出原始數(shù)據(jù)。
　　3.運(yùn)用BeadStudio Methylation Module v3.2軟件分析數(shù)據(jù)。甲基化程度的高低依據(jù)掃描回饋結(jié)果average Beta值（AVB，反映樣本CpG位點(diǎn)甲基化程度，數(shù)值越大，越趨近于1，甲基化程度越高），根據(jù)|DiffScore|≥20進(jìn)行甲基化程度差異性位點(diǎn)的篩選。
　　4.通過焦硫酸測(cè)序

6、技術(shù)，利用10對(duì)同胞對(duì)（與全基因組DNA甲基化芯片檢測(cè)分析對(duì)象相同）外周血DNA，檢測(cè)GABRP、ALDH1L2、DBH、及GAD1基因甲基化程度，并與芯片結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，觀察芯片結(jié)果與焦硫酸測(cè)序結(jié)果的相符情況，驗(yàn)證芯片技術(shù)的可靠性。
　　5.運(yùn)用Database forAnnotation, Visualization and Integrated Discovery6.7(DAVID; http://abcc.ncifcrf

7、.gov)、Gene Ontology(GO; http://www.geneontology.org/)和the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG;http://www.genome.jp/kegg/)對(duì)差異性位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)通路分析。
　　6.通過焦硫酸測(cè)序技術(shù)，利用病例組（63例，不包括上述10對(duì)同胞對(duì)中的酒依賴患者）與健康對(duì)照組（65例）外周血DNA，對(duì)SSTR4基因和G

8、ABRP的差異性位點(diǎn)進(jìn)行甲基化狀態(tài)檢測(cè)分析，驗(yàn)證基于同胞對(duì)的分析結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.臨床研究
　　(1)AD平均年齡為(44.9±5.9)歲，未患病同胞平均年齡為（44.2±7.2）歲，兩組年齡無顯著性差異(P＞0.05)。病例組年齡（39.1±7.3）歲，健康對(duì)照組年齡(39.6±8.1)歲，兩組年齡無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2)10對(duì)酒依賴同胞對(duì)在AUDIT、LES及Wheatley應(yīng)激量

9、表評(píng)分的差異性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AUDIT(t=8.246,P＜0.05),LES(t=5.453,P＜0.05),Wheatley應(yīng)激量表（t=7.981，P＜0.05）。
　　(3)63例酒依賴患者與65例健康對(duì)照在AUDIT、LES及Wheatley應(yīng)激量表評(píng)分的差異性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AUDIT(t=16.301, P＜0.05),LES(t=14.440,P＜0.05),Wheatley應(yīng)激量表(t=21.779，P＜0

10、.05)。
　　2.10對(duì)酒依賴同胞對(duì)全基因組甲基化芯片檢測(cè)結(jié)果及驗(yàn)證通過芯片檢測(cè)分析及結(jié)果分析，共有865個(gè)低甲基化位點(diǎn)和716個(gè)高甲基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)涉及到827個(gè)已知基因。最高甲基化位點(diǎn)位于GABRP基因，最低甲基化位點(diǎn)位于SSTR4基因。10對(duì)同胞對(duì)焦硫酸測(cè)序結(jié)果與芯片結(jié)果相關(guān)性較好，GABRP基因、ALDH1L2、GAD1及DBH基因的R2依次為:0.998，0.954，0.986，0.996，顯示芯片檢測(cè)結(jié)果可靠。

11、r>　　3.生物學(xué)通路分析通過GO分析，這些差異性位點(diǎn)參與13條生物學(xué)過程、19條分子功能和20條分子構(gòu)成。通過KEGG分析，130個(gè)包含差異位點(diǎn)的基因中，33個(gè)基因?qū)儆诖x通路。
　　4.病例對(duì)照驗(yàn)證分析病例組SSTR4基因與對(duì)照組SSTR4基因的甲基化程度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.723，P＜0.05)，并且病例組SSTR4基因的CG％比例低于對(duì)照組。病例組GABRP基因與對(duì)照組GABRP基因的甲基化程度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、(t=32.622，P＜0.05)，并且病例組GABRP基因的CG％比例高于對(duì)照組。這與芯片結(jié)果相同，兩組方法的結(jié)果比較相符，相互驗(yàn)證。
　　結(jié)論:
　　1.男性酒依賴患者與同胞對(duì)及健康對(duì)照相比，遭遇較多負(fù)性生活事件及有較高的應(yīng)激水平，說明環(huán)境因素在酒依賴的形成與維持過程中起到一定作用。
　　2.男性酒依賴患者存在全基因組水平DNA甲基化異常，共有865個(gè)低甲基化位點(diǎn)和716個(gè)高甲基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)涉及到827個(gè)已知基