牦牛miR--487b和miR--433對C2C12增殖和分化調(diào)控作用的研究.pdf

1、骨骼肌正常發(fā)育是機(jī)體維持一系列重要生命活動的基礎(chǔ)，而成肌細(xì)胞的增殖與分化是骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此研究成肌細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是發(fā)育生物學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。成肌細(xì)胞的增殖與分化受到一系列轉(zhuǎn)錄因子以及miRNAs的調(diào)控。miRNAs一類長度為18-22nt的非編碼小RNA，其通過與靶mRNA結(jié)合來下調(diào)靶基因表達(dá)，進(jìn)而參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控。諸多研究表明，miRNAs在骨骼肌發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用?；趯?shí)驗(yàn)室前期對大通牦牛胎牛和

2、成年牦牛背最長肌miRNAs高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR-487b和miR-433在牦牛胎牛背最長肌中的表達(dá)極顯著高于成年牦牛，推測這兩個miRNAs可能參與調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育。因此本研究將小鼠成肌細(xì)胞系(C2C12)作為細(xì)胞模型，來探究miR-487b和miR-433在成肌細(xì)胞增殖和分化過程中的作用，為進(jìn)一步完善骨骼肌發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)。
　　本研究通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics或inhibitor實(shí)現(xiàn)miRNAs的過表達(dá)或

3、抑制表達(dá)，研究牦牛miR-487b和miR-433在C2C12細(xì)胞增殖與分化過程中的功能。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證PITX2是miR-487b的直接靶基因，進(jìn)一步闡明miR-487b在骨骼肌發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　(1)克隆測序獲得牦牛miR-487b和miR-433成熟序列，保守性分析發(fā)現(xiàn)，miR-487b和miR-433成熟序列在各物種間高度保守。小鼠組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，miR-487b和miR-433在骨

4、骼肌中表達(dá)豐度最高。
　　(2)miR-487b和miR-433在C2C12細(xì)胞增殖階段表達(dá)量逐漸上調(diào)。過表達(dá)miR-487b和miR-433后，增殖標(biāo)記基因PCNA、CCNB1和MKI67mRNA表達(dá)量顯著增加，PCNA蛋白表達(dá)量也顯著提高。CCK-8法檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)miR-487b和miR-433組均能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。相反，抑制miR-487b和miR-433后，PCNA、CCNB1和MKI67表達(dá)量下調(diào)，

5、且C2C12細(xì)胞增殖活性顯著降低。表明miR-487b、miR-433促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖。
　　(3)體外成功構(gòu)建C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系，隨著誘導(dǎo)分化時間延長，miR-487b和miR-433表達(dá)量呈上升趨勢。過表達(dá)miR-487b和miR-433后，分化標(biāo)志基因MYOD、MYOG、MYHC在mRNA和蛋白水平均顯著降低。相反，抑制miR-487b、miR-433表達(dá)后，MYOD、MYOG、MYHC在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上升