mir-374b和miR-299對(duì)成肌細(xì)胞分化的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、骨骼肌的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括成肌細(xì)胞的增殖、分化和肌管的形成等，這一過(guò)程受到一系列的信號(hào)分子，如轉(zhuǎn)錄因子等的調(diào)節(jié)。microRNA(miRNA)是動(dòng)植物中廣泛存在的、物種間高度保守的、長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸左右的一類單鏈小分子非編碼的RNA，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。近年來(lái)，隨著對(duì)microRNA研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)這類單鏈小分子RNA參與了骨骼肌發(fā)育的調(diào)節(jié)。Myf6是生肌調(diào)節(jié)因子MRFs（Myogenic Regulator

2、y Factors）家族的一員，它可以識(shí)別并結(jié)合于許多肌肉發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控肌肉的發(fā)育。本研究鑒定了直接靶定Myf63'UTR的microRNAs，主要研究了miR-374b和miR-299對(duì)C2C12成肌細(xì)胞分化的影響，主要工作及結(jié)果如下:
　　1.調(diào)節(jié)Myf6基因的microRNA鑒定
　　通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)了miR-299、miR-374b、miR-376c、miR-377、miR-499和miR-669f是

3、直接靶定Myf6基因的候選microRNAs。我們構(gòu)建了482bp的包含有候選microRNAs結(jié)合位點(diǎn)的My f63'UTR野生型和突變掉miR-299和miR-374b結(jié)合位點(diǎn)的Myf63'UTR突變型雙熒光素酶報(bào)告載體。證明了miR-374b能夠直接靶定Myf63'UTR并調(diào)控內(nèi)源Myf6表達(dá)。
　　2.miR-374b在肌細(xì)胞分化中的作用
　　利用Q-PCR分別分析了miR-374b的組織表達(dá)譜和miR-374b在成

4、肌細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式。miR-374b在2月齡C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、脂肪、骨骼肌九個(gè)組織廣泛表達(dá);miR-374b在C2C12成肌細(xì)胞分化的第0h、24h、72h和96h呈先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)。
　　我們通過(guò)超表達(dá)和抑制內(nèi)源miR-374b表達(dá)，研究了miR-374b在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示，在超表達(dá)miR-374b后，分化標(biāo)志基因MyoG的表達(dá)量增加，而MyoD和Myf5基因

5、的mRNA水平變化不明顯。但western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈(MyHC)的蛋白水平明顯降低，免疫熒光檢測(cè)也顯示細(xì)胞融合率下降;相反，轉(zhuǎn)染miR-374b的抑制劑，抑制miR-374b的表達(dá)，肌球蛋白重鏈的蛋白水平明顯升高，免疫熒光檢測(cè)顯示細(xì)胞融合率上升。因此，我們證實(shí)了miR-374b負(fù)向調(diào)控C2C12成肌細(xì)胞的分化。另外，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示miR-374b促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞的增殖。
　　miR-374b在腓腸?。ɑ?/p>

6、合型肌纖維）中的表達(dá)量高于比目魚(yú)?。±w維）的表達(dá)量。在超表達(dá)miR-374b的C2C12細(xì)胞中，Myh7（慢?。┖蚆yh4（快?。┑谋磉_(dá)量均有下降，但是Myh7的下降幅度要大于Myh4的下降幅度，說(shuō)明miR-374b可以同時(shí)抑制快肌纖維和慢肌纖維的形成，但是對(duì)慢肌的抑制作用更加明顯。
　　3.miR-299在肌細(xì)胞分化中的作用
　　同樣，我們利用Q-PCR分別分析了miR-299組織表達(dá)譜以及miR-299在成肌細(xì)胞分化

7、過(guò)程中的表達(dá)模式。在2月齡C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、脂肪、骨骼肌九個(gè)組織中，miR-299廣泛表達(dá);miR-299在C2C12成肌細(xì)胞分化的第0h、24h、72h和96h，表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。
　　通過(guò)超表達(dá)和抑制內(nèi)源miR-299表達(dá)實(shí)驗(yàn)，我們研究了miR-299在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-299后，分化標(biāo)志基因MyoG，MyoD，My f5的mRNA水平均上升;通過(guò)轉(zhuǎn)染miR