miR-21在P12CDK2AP1表達(dá)調(diào)控中的作用及其對細(xì)胞侵襲和增殖的影響.pdf

1、頭頸部腫瘤大約占機(jī)體全部腫瘤的5％左右，而80-90％的頭頸部腫瘤是由鱗狀細(xì)胞癌構(gòu)成的。雖然腫瘤的診治得到了迅速的發(fā)展，但頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的5年總體生存率在大多數(shù)腫瘤中仍然是較低的一類腫瘤。腫瘤抑制因子P12CDK2AP1負(fù)向調(diào)節(jié)CDK2的活性并能夠抑制DNA的復(fù)制，而它在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)卻是被明顯下調(diào)甚至缺失的。目前P12CDK2AP1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中所發(fā)揮的作用尚不明確。因此闡明P12CDK2AP1在頭頸部鱗癌發(fā)生、發(fā)展過

2、程中的作用顯得尤為重要。本項研究證實在頭頸部鱗癌中miR-21在P12CDK2AP1調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用，或許可以成為一個有效的治療靶點(diǎn)。
　　目的：
　　1.研究P12CDK2AP1在細(xì)胞生物學(xué)行為（侵襲和增殖）中所發(fā)揮的作用。
　　2.探索P12CDK2AP1是否受到miRNAs的調(diào)控，以及這種調(diào)控所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法：
　　1.包含CMV和U6啟動子，可以通過限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)連接編碼s

3、hRNAs寡核苷酸的第三代自失活病毒載體購自上海吉凱基因有限公司。我們構(gòu)建了四對針對于人CDK2AP1-mRNA的慢病毒干擾序列載體，分別命名為KD-1,KD-2，KD-3和KD-4.以HEK293T細(xì)胞為工具細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝，最終選取KD-3進(jìn)行各個實驗組的慢病毒感染和后續(xù)的實驗。
　　2．CDK2AP1-mRNA和蛋白水平的檢測通過QuantitativeRealTimePCR和Westernblot分析進(jìn)行。
　　3

4、.根據(jù)CDK2AP1GenBank序列號No.NM_004642,我們利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了與該基因相互作用的miRNAs靶點(diǎn)。最終我們選定了miR-21進(jìn)行后續(xù)的實驗研究。
　　4.我們在CDK2AP1基因3'-UTR區(qū)克隆了一個包含miR-21潛在作用位點(diǎn)的報告質(zhì)粒。從而通過報告基因系統(tǒng)對預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。
　　5.分別將pre-miR-21或者anti-miR-21進(jìn)行相應(yīng)組別的轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行生物學(xué)效應(yīng)

5、的檢測：細(xì)胞增殖活性的檢測如MTT和流式細(xì)胞術(shù)分析；以及細(xì)胞侵襲的相關(guān)分析如軟瓊脂培養(yǎng)和Transwell侵襲測定。
　　結(jié)果：
　　1.在HaCaT細(xì)胞（人源性角化上皮細(xì)胞）的lenti-shCDK2AP1感染組，CDK2AP1-mRNA和P12CDK2AP1的表達(dá)水平被明顯調(diào)低。
　　2.P12CDK2AP1表達(dá)被調(diào)低以后可以明顯促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化。
　　3.通過生物學(xué)信息軟件我們預(yù)測到CDK

6、2AP1基因3'-UTR區(qū)存在著miR-21的作用位點(diǎn)。并通過報告基因系統(tǒng)進(jìn)行了進(jìn)一步驗證。
　　4.通過實驗證實在HaCaT和Tca8113細(xì)胞中P12CDK2AP1和miR-21的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　5.實驗數(shù)據(jù)顯示，miR-21能夠下調(diào)P12CDK2AP1的表達(dá)，并能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和增殖能力。
　　結(jié)論：
　　1.在本項研究中，我們構(gòu)建了可以攜帶特定基因干擾序列的慢病毒載體，并證實在感染細(xì)胞的過程中它可以