家蠶miR-0001和miR-0015對(duì)BmFib-L基因表達(dá)的調(diào)控作用研究.pdf

1、microRNA(miRNA)為一類單鏈短非編碼RNA，其長(zhǎng)度約為20-25nt，主要通過與靶mRNA的3'端非編碼區(qū)相結(jié)合從而抑制靶基因的表達(dá)或翻譯，在基因的轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因發(fā)揮調(diào)控作用。家蠶是絹絲類經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是僅次于果蠅的第二大模式昆蟲，它既具備其他昆蟲共有的生物性狀，又具有其自身獨(dú)特的產(chǎn)絹絲特性。因此，開展家蠶miRNA的研究將有助于揭示miRNAs在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過程所發(fā)揮的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)家蠶后部絲腺 sRNA進(jìn)行高

2、通量測(cè)序，獲得35個(gè)新的bmo-miRNA。為了驗(yàn)證這些miRNA對(duì)絲素基因表達(dá)的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)以絲素輕鏈基因 BmFib-L為靶基因，從中篩選對(duì) BmFib-L具有調(diào)控作用的miRNA，利用半定量 RT-PCR方法對(duì)它們進(jìn)行表達(dá)分析，并進(jìn)一步采用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞水平驗(yàn)證其對(duì)BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用，取得如下主要結(jié)果：
　　1. bmo-miR-0001和miR-0015在BmFib-LmRNA3′UTR存在靶位

3、點(diǎn)
　　利用RNAhybrid靶基因在線預(yù)測(cè)軟件，以BmFib-L為靶基因，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室在前期Solexa測(cè)序獲得的35個(gè)新bmo-miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得2個(gè)在BmFib-L mRNA3′UTR具有潛在結(jié)合位點(diǎn)的候選miRNA，即bmo-miR-0001和-0015。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)PCR引物，克隆候選miRNA，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。同時(shí)對(duì)它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，bmo-miR-0001和-0015的前體均能形成典型的莖

4、環(huán)結(jié)構(gòu)，并包含完整的成熟體miRNA序列且都處于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的臂上，符合miRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。
　　2. bmo-miR-0001和miR-0015具備調(diào)控BmFib-L表達(dá)的組織特異性條件
　　設(shè)計(jì)莖環(huán)引物，采用RT-PCR方法，對(duì)家蠶5齡3d幼蟲的頭部、表皮、脂肪體、馬氏管、精巢/卵巢、絲腺（前、中、后）、氣管、中腸和血淋巴細(xì)胞等12個(gè)不同組織的bmo-miR-0001、-00015和BmFib-L進(jìn)行了半定量表達(dá)分析。

5、結(jié)果顯示，BmFib-L在后部絲腺的表達(dá)水平最高，兩個(gè)miRNA在后部絲腺的相對(duì)表達(dá)量都明顯高于其他組織，說明它們存在調(diào)控BmFib-L基因表達(dá)的組織特異性條件。
　　3．Bmo-miR-0001和miR-0015對(duì)BmFib-L基因的表達(dá)具有抑制作用
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證bmo-miR-0001和miR-0015對(duì)BmFib-L的調(diào)控作用，分別構(gòu)建了表達(dá)mir-0001和mir-0015的重組質(zhì)粒pcDNA3.0[ie1-eg

6、fp-pri-mir-0001-SV40]和pcDNA3.0[ie1-egfp-pri-mir-0015-SV40]，以及表達(dá)BmFib-L3'UTR的重組質(zhì)粒pGL3[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]，在家蠶BmN細(xì)胞中共表達(dá)，并以海腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-CMV為內(nèi)參，通過檢測(cè)熒光素酶活性，分析mir-0001和mir-0015對(duì)BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-0001和miR-0015表達(dá)質(zhì)粒