諾卡菌16S rRNA基因菌種鑒定及基因組測序分析.pdf

1、目的：
　　諾卡菌是一種重要的機會性致病菌，人類通過呼吸道或經(jīng)傷口感染后，能引發(fā)多種臨床癥狀，嚴重時可造成死亡。隨著諾卡菌感染率的逐年增加，逐漸引起人們對該病原菌的重視。本研究利用16S rRNA基因分析諾卡菌種間的序列，以研究16SrRNA基因分型方法在臨床應(yīng)用中諾卡菌菌種鑒定的應(yīng)用價值，為臨床應(yīng)用中快速、準確鑒定諾卡菌奠定基礎(chǔ)。選取20株諾卡菌進行二代高通量測序，應(yīng)用最小核心基因組分型方法對諾卡菌進行分型和鑒定，同時對基因組的

2、毒力基因進行分析，為諾卡菌的分子分型提供新的思路，也為進一步研究諾卡菌的致病機制提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　1.對49株諾卡菌16SrRNA基因進行擴增，將獲得的序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的32株諾卡菌的16S rRNA基因序列進行分析，應(yīng)用DNASTAR程序?qū)@81株諾卡菌16S rRNA基因的序列分析處理，計算種內(nèi)及種間相似性，用MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
　　2.選取20株諾卡菌，提取核酸構(gòu)建二代

3、高通量測序文庫，利用Illumina Hiseq2500高通量測序平臺完成文庫樣品測序，采用SOAP denovo軟件對測序之后得到的數(shù)據(jù)進行組裝，應(yīng)用OrthoMCL程序，對從本研究測序的20株諾卡菌基因組數(shù)據(jù)和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的37株諾卡菌基因組數(shù)據(jù)進行最小核心基因組的分析。應(yīng)用Muscle和MEGA6.06軟件，構(gòu)建基于最小核心基因組(minimalcore genome，MCG)的聚類樹。對毒力基因的分析，則通過Pu

4、bmed文獻檢索功能查詢諾卡菌的毒力相關(guān)基因，分析毒力相關(guān)基因在不同諾卡菌的分布情況及毒力基因的同源性研究，并利用Cluster/TreeView軟件畫出毒力相關(guān)基因分布熱力圖。
　　結(jié)果:
　　1.諾卡菌16S rRNA基因序列種內(nèi)相似性為99.1％～100％，種內(nèi)相似度最高的有鼻疽諾卡菌、短鏈諾卡菌和克魯吉亞諾卡菌，均可達100％;種內(nèi)相似性最低有星形諾卡菌和南非諾卡菌，分別為99.2％和99.1％。諾卡菌屬16S rR

5、NA基因種內(nèi)及亞種間相似性均在99.0％以上;諾卡菌種間16SrRNA基因序列相似性為95.5％～98.8％，其中膿腫諾卡菌和星形諾卡菌相似度最大，達98.1％～98.8％;南非諾卡菌和肉色諾卡菌相似性最低，為95.5％～96.0％。
　　2.以膿腫諾卡菌(DSM44432)作為變異點參考序列，分析諾卡菌16SrRNA基因序列中堿基變異位點及其易變區(qū)，諾卡菌16SrRNA基因序列（選取1392bp的測序可信長度）存在的堿基變異位點

6、有116個，易變區(qū)大致可分為4個，分別在119bp～137bp、515 bp～542bp、919bp～941bp、1031bp～1068bp位點之間。
　　3.基于納入分析的諾卡菌16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，在進化樹中13種諾卡菌大致被聚集為11個群，還有3種諾卡菌無法有效分離，屬于新星諾卡菌復(fù)合物即老兵諾卡菌、非洲諾卡菌和克魯吉亞諾卡菌。另外，本研究中所選取的臨床分離株（已被鑒定為鼻疽諾卡菌），在進化樹中與鼻疽諾

7、卡菌標準株聚集成一簇，其親緣關(guān)系也十分相近。
　　4.選取20株諾卡菌進行全基因組測序分析，共獲得雙末端測序數(shù)據(jù)40Gb左右，12，608，226個讀段(read)，每株菌平均測序深度為418×（基因組上每一個單堿基平均被測序或者讀取了418次），最大測序深度可達到629×。每株菌的reads經(jīng)過拼接組裝，基因組大小差異較大，最小為6.08Mbp，最大可達9.45Mbp;平均可預(yù)測得到6963個基因/菌株;平均(G+C)含量為68

8、％。
　　5.對57株諾卡菌的基因組數(shù)據(jù)使用MCG分型方法分析，獲取225個基因構(gòu)成最小核心基因組，在整個基因組中占比不到4％;最小核心基因組基因功能主要以基礎(chǔ)代謝調(diào)控、物質(zhì)轉(zhuǎn)運為主。其中，以翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成功能占比例最大，其次為翻譯，氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝，輔酶的轉(zhuǎn)運和代謝功能，所占比例最小的是防御功能相關(guān)基因。
　　6.基于核心基因組的串聯(lián)序列，構(gòu)建諾卡菌核心基因組聚類樹，各個種的諾卡菌多數(shù)能分在不同的分支上，同種的

9、諾卡菌絕大部分可聚成一簇;而ICDC83老兵諾卡菌與新星諾卡菌、少食和短鏈諾卡菌分別聚在同一分支，且親緣關(guān)系很近;聚集成一簇的鼻疽諾卡菌間遺傳距離不一。
　　7.210個毒力基因在30種諾卡菌中的攜帶數(shù)量為15(7.1％)～170(80.9％)，其中蓋爾森基興諾卡菌GUH-2內(nèi)毒力基因數(shù)量最多，為170(80.9％);其次為巴西諾卡菌(153，72.8％)、鼻疽諾卡菌(144，68.6％)、Nocardia tenerifensi

10、s(131，62.4％)，均分離自人;諾卡菌屬348MFTsu5所含毒力基因數(shù)量，最少為15(7.1％)，分離自自然界。
　　8.諾卡菌的毒力基因主要編碼過氧化氫酶，超氧化物歧化酶，細胞壁脂質(zhì)，蛋白酶，mce蛋白等。210個毒力基因中，mce基因所攜帶的數(shù)目最多，為48個，占22.9％;其次為蛋白酶(potease)基因，攜帶有46個，占21.9％，編碼脂蛋白(Lipoprotein)，亞硝酸還原酶(Nitrite reducta

11、se)基因也有一定數(shù)目，分別為19個(7.6％)和11個(5.2％)。
　　9.13個毒力相關(guān)基因(nfa13050，nfa37890，NOCYR_0626，NOCYR_0144，NOCYR_5051, NOCYR_0327, NOCYR_0407, NOCYR_1396, NOCYR_1397,NOCYR_2248，NOCYR_5510，NOCYR_0085，NOCYR_0548)在57株諾卡菌基因組中均存在，編碼蛋白酶，超氧化

12、物歧化酶，ABC轉(zhuǎn)運蛋白，烷基氫過氧化物還原酶，龍膽酸，異檸檬酸裂解酶等，與基礎(chǔ)代謝調(diào)控與物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.16S rRNA基因序列分析是一種簡單，快速，特異性好的諾卡菌菌種鑒定方法，除了諾卡菌復(fù)合體內(nèi)亞種無法分離外，能將基他諾卡菌株鑒定至種的水平?？稍谂R床上廣泛應(yīng)用。
　　2.基于最小核心基因組構(gòu)建聚類樹中大致能將諾卡菌不同種聚集成不同的群，諾卡菌復(fù)合體亞種也無法分離開;但是在鼻疽諾卡菌在MCG聚類