細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2及其代謝產(chǎn)物EETs通過PPARα發(fā)揮抗心肌肥厚的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　心肌肥厚是心臟對于壓力負(fù)荷或者容量負(fù)荷所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，是一種緩慢、復(fù)雜而且合并諸多因素參與的動態(tài)過程，通常是由心臟的基礎(chǔ)疾病如心臟瓣膜病、高血壓病、先天性心臟病、心肌缺血等導(dǎo)致。心肌肥厚在宏觀上主要表現(xiàn)為心室腔縮小、心室壁增厚，而在微觀上則以心肌細(xì)胞增大、心肌纖維增粗或者成簇樣改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)。在心肌肥厚發(fā)生的早期，其可以降低心室壁的壓力，維持心臟的功能，保證外周組織器官的血供。然而隨著壓力或者容量負(fù)荷的持續(xù)存在

2、，心肌肥厚的進一步進展，伴隨著心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等的發(fā)生，其終將發(fā)展成心力衰竭，甚至導(dǎo)致死亡。因此，深入探討心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制、尋找心肌肥厚的有效治療靶點和治療策略，具有非常重要的意義。
　　花生四烯酸是生物體內(nèi)含量最為豐富的不飽和脂肪酸之一。它可通過細(xì)胞色素P450表氧化酶代謝途徑代謝成為環(huán)氧二十碳三烯酸（Epoxyeicosatrienoic acids, EETs）。研究證實，EETs在心血管系統(tǒng)中有著諸多的保護作

3、用，比如EETs可以舒張血管、降低血壓，可以抑制動脈粥樣硬化以及抑制主動脈瘤形成等。同時，研究還表明，EETs在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中具有良好的保護作用，可以預(yù)防心肌肥厚的發(fā)生，甚至達到治療心肌肥厚以及心力衰竭的目的。然而截至目前，EETs抵抗心肌肥厚的具體作用機制尚未明了。結(jié)合國內(nèi)外的研究，我們推測過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha，PPAR

4、α）很有可能介導(dǎo)了EETs的抗心肌肥厚作用。因此，本課題以PPARα缺陷（PPARα null）小鼠作為研究對象，通過重組腺相關(guān)病毒（recombinant Adeno Associated Virus，rAAV）系統(tǒng)介導(dǎo)小鼠心臟高表達CYP2J2基因以及對照的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein GFP）基因，并采用血管緊張素II（Angiotensin II，Ang II）皮下微泵植入誘導(dǎo)心肌肥厚，以探討

5、CYP2J2過表達對心肌肥厚的作用及其與PPARα的關(guān)系，并對其分子機制進行深入探索。
　　研究方法和結(jié)果：
　　1.首先，我們在293T細(xì)胞中通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法成功包被攜帶有CYP2J2基因和GFP基因的的重組腺相關(guān)病毒，即rAAV-2J2和rAAV-GFP，并對其進行純化。純化后將其感染細(xì)胞檢測感染效率，并且通過尾靜脈注射注入至動物體內(nèi)，4周后留取動物的心臟、血液和尿液，采用Western blot技術(shù)和real t

6、ime RT-PCR的方法檢測心臟組織中CYP2J2的蛋白和mRNA的水平，并采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠血、尿中11,12-EET、11,12-DHET、14,15-EET以及14,15-DHET的水平。結(jié)果表明，我們所包被的病毒具有很高的感染效率，而且其可以介導(dǎo)CYP2J2在小鼠心臟中表達，同時與對照組相比，接受rAAV-2J2病毒組的血、尿中EETs和DHETs的水平明顯升高。
　　2.為了驗證CYP2J2介導(dǎo)的抗心肌肥厚作

7、用是否與PPARα有關(guān)，我們以8周大的雄性PPARαnull小鼠以及相同背景的野生（Wild type, WT）小鼠作為研究對象，并通過小鼠尾靜脈注射攜帶有CYP2J2基因和GFP基因的重組腺相關(guān)病毒，采用皮下微泵植入給予 Ang II（1.5μg·Kg-1·min-1）持續(xù)刺激。兩種小鼠均分為如下4組：NS+rAAV-GFP組、NS+rAAV-2J2組、Ang II+rAAV-GFP組、Ang II+rAAV-2J2組，每組8只。在A

8、ng II干預(yù)兩周后，通過小鼠超聲系統(tǒng)，對小鼠的心室腔大小和心室壁厚度等進行檢測。并且通過心導(dǎo)管技術(shù)以及Millar系統(tǒng)對小鼠的心臟血液流變學(xué)功能進行檢測。檢測結(jié)果表明，無論是在WT小鼠還是PPARαnull小鼠中，Ang II可以明顯的誘導(dǎo)小鼠心臟心室壁增厚，心室腔縮小以及心室內(nèi)壓力最大變化速率降低。同時，在WT小鼠中，CYP2J2過表達可以明顯的抑制Ang II的作用，但是在PPARα null小鼠中，CYP2J2卻不能發(fā)揮抑制An

9、g II的效應(yīng)。
　　3.在上述檢測之后，將動物人性化處死并分離心臟，觀察心臟大小，記錄心臟重量。采用蘇木素-伊紅染色以及 WGA染色觀察小鼠心肌細(xì)胞面積，同時應(yīng)用 real time RT-PCR方法對小鼠心臟組織中心肌肥厚標(biāo)志物（βMHC和BNP）進行檢測，并提取心臟的總蛋白和胞漿胞核蛋白組分，采用Western blot技術(shù)檢測心臟中ERK1/2、MAPK的激活水平，IκBα的表達情況和NFκB的激活情況。結(jié)果顯示，無論是在

10、野生小鼠還是PPARαnull小鼠，Ang II可以明顯的誘導(dǎo)心臟增大、增重，促進心肌細(xì)胞面積增大，誘導(dǎo)心肌肥厚標(biāo)志物（βMHC和BNP）的表達，并促進MAPK（ERK1/2、MAPKP38）和IκBα的激活，促進NFκB的核轉(zhuǎn)移。而且在WT小鼠中，將Ang II+ rAAV-GFP組與Ang II+rAAV-2J2組相比，CYP2J2過表達可以抑制心臟增大、增重，抑制心肌細(xì)胞面積的增大以及βMHC和 BNP的表達增加，這一作用可能與其

11、抑制 MAPK和NFκB通路的激活有關(guān)。然而，在PPARαnull小鼠中，CYP2J2過表達卻不能發(fā)揮類似的效應(yīng)。
　　4.另外，我們還以大鼠心肌細(xì)胞系 H9c2細(xì)胞以及原代提取的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞作為研究對象，并外源性加入EETs以及PPARα特異性阻斷劑GW6471，觀察EETs對于Ang II的促心肌肥大的作用。在體外研究中，我們采用F-actin染色觀察心肌細(xì)胞的面積，并采用real time RT-PCR方法對心肌細(xì)胞中β

12、MHC和BNP的表達進行檢測，同時提取細(xì)胞總蛋白和胞漿胞核蛋白組分，采用Wenstern blot技術(shù)檢測細(xì)胞中Cav-1、ERK1/2、MAPK-P38以及IκBα的激活情況和胞漿胞核NFκB的表達。此外，我們還采用了免疫沉淀的方法，檢測細(xì)胞中Ras-GTP的表達，即Ras的激活情況。研究結(jié)果表明，與對照組相比，單純Ang II刺激可以明顯的誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增大，誘導(dǎo)細(xì)胞中βMHC和BNP的表達增加，同時激活了Ras/MAPK和NFκB

13、通路，而加入11,12-EET干預(yù)可以顯著的抑制Ang II所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增大、抑制βMHC和BNP的表達、抑制Ras/MAPK和NFκB通路的激活，然而11,12-EET拮抗Ang II誘導(dǎo)的心肌肥大的這一效應(yīng)，可以被14,15-EEZE以及PPARα特異性阻斷劑GW6471所阻斷。同時我們還觀察到，11,12-EET干預(yù)可以明顯的誘導(dǎo) Cav-1的表達，而 GW6471則可以阻斷11,12-EET的作用。以上結(jié)果表明，11,12-

14、EET可以通過PPARα調(diào)控Cav-1的表達。
　　5.為了進一步的驗證PPARα與Cav-1表達調(diào)控之間的關(guān)系，我們通過轉(zhuǎn)錄預(yù)測網(wǎng)站在Cav-1啟動子的保守區(qū)預(yù)測到了PPARα的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點，構(gòu)建了含有不同長度的Cav-1的啟動子區(qū)的截短克隆，通過PPARα在細(xì)胞中高表達PPARα并采用熒光報告基因系統(tǒng)檢測PPARα是否可以結(jié)合Cav-1的啟動子區(qū)并啟動下游基因的表達。同時，我們還使用了染色質(zhì)免疫沉淀的方法，以Cav-1啟動子區(qū)

15、的多段引物進行PCR反應(yīng)，再次驗證檢測PPARα與Cav-1啟動子區(qū)是否可以結(jié)合。研究結(jié)果表明，對于上游500bp（-8到-492）以及上游1250bp（-8到-1278）的截短克隆中，與對照組相比，PPARα高表達組熒光素酶活性顯著增高。染色質(zhì)免疫沉淀的結(jié)果也表明，與對照組相比，PPARα高表達組中可以擴增出更多的-199至-455的Cav-1啟動子片段，而其他引物所擴增出的產(chǎn)物在兩組間沒有明顯的差異。因此，我們的結(jié)果表明，PPARα

16、可以與Cav-1啟動子區(qū)的-199到-455區(qū)域發(fā)生結(jié)合，促進Cav-1的表達。
　　6.最后，我們在原代提取的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞中，采用siRNA介導(dǎo)Cav-1的沉默，并使用F-actin染色、real time RT-PCR方法以及Western blot方法觀察Cav-1在EET發(fā)揮抗心肌肥厚過程中的作用。結(jié)果表明，與對照組相比，Ang II可以明顯的促進心肌細(xì)胞面積增大、βMHC以及BNP的表達增加，刺激MAPK和NFκB通

17、路的激活，將Ang II組與Ang II+11,12-EET組相比，11,12-EET干預(yù)可以顯著的抑制Ang II的效應(yīng)，但是將Ang II+11,12-EET組與Ang II+11,12-EET+Cav-1 siRNA組相比，Cav-1沉默可以顯著的抑制11,12-EET的作用，促進Ang II所誘導(dǎo)的心肌肥大。
　　結(jié)論：
　　1.在體內(nèi)研究中，Ang II微泵植入可以明顯的誘導(dǎo)心肌肥厚，包括心臟的形態(tài)學(xué)改變（心室壁增

18、厚、心臟增大）、血液流變學(xué)改變（心室內(nèi)壓力變化速率下降、心室舒張末期壓力增高等）、病理學(xué)改變（心肌細(xì)胞面積增大）和分子層面改變（心肌肥厚標(biāo)志物表達增加），而CYP2J2過表達可以明顯的抑制Ang II所誘導(dǎo)的心肌肥厚，并且這一作用可能是由PPARα介導(dǎo)的；
　　2.在離體研究中，Ang II干預(yù)可以明顯的刺激心肌細(xì)胞發(fā)生心肌肥大，外源性加入11,12-EET可以明顯的抑制Ang II所誘導(dǎo)的心肌肥大，而這一效應(yīng)可以被PPARα特異