細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡減輕肺缺血再灌注損傷.pdf

1、肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)是一類嚴(yán)重影響人類健康而又難以避免的并發(fā)癥,常見于肺移植、體外循環(huán)、肺袖式切除術(shù)、肺動(dòng)脈成形術(shù)、心臟手術(shù)、肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)、心肺復(fù)蘇等情況。再灌注是一把雙刃劍，既是恢復(fù)和維持缺血區(qū)肺功能所必須，同時(shí)又誘發(fā)一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷。肺缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多因素的病理生理過程，常涉及炎癥、氧化應(yīng)激、白細(xì)胞活化、細(xì)胞內(nèi)鈣

2、超載、自由基產(chǎn)生、促炎介質(zhì)釋放、細(xì)胞表面膜分子上調(diào)、蛋白酶釋放、及保護(hù)性介質(zhì)如肺泡表面活性物質(zhì)減少等。臨床上，常特征性表現(xiàn)為肺水腫、肺動(dòng)脈高壓、肺血管阻力增加、及肺血管通透性增加。不幸的是，肺缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的嚴(yán)重后果并不局限于肺部。很多情況下，局部炎癥反應(yīng)可誘發(fā)全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致多器官功能障礙，甚至引起死亡。然而，目前對于肺缺血再灌注損傷的預(yù)防或治療仍缺乏行之有效的藥物和方法。因此，迫切需要對肺缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制進(jìn)

3、行深入研究，以探討新的預(yù)防和治療策略。
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞是肺缺血再灌注損傷的重要介質(zhì)。缺血可激活NF-κB、NADPH、鈣調(diào)蛋白依賴性一氧化氮合酶(nitric oxygen synthase,NOS)，增加促炎細(xì)胞因子水平，使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加，并上調(diào)細(xì)胞表面膜分子。上述變化直接或間接作用于微循環(huán)系統(tǒng)，引起肺血管阻力增加和微血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致再灌注后肺水腫，引起通氣

4、血流比例失調(diào)，導(dǎo)致氧合功能異常加重缺氧。在肺缺血再灌注損傷的早期，內(nèi)皮細(xì)胞主要表現(xiàn)為凋亡，而非壞死。
　　細(xì)胞色素P450表氧化酶(cytochrome P450 epoxygenase,CYP)是一個(gè)巨大的氧化酶超家族，包括2C和2J兩類。目前已知6種克隆的2J，而在人體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)了2J2。CYP2J2在血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中高表達(dá)，在肝臟、腎臟等組織中也有分布。CYP2J2可以代謝花生四烯酸生成4種同源異構(gòu)的環(huán)氧化二十碳三烯酸

5、(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)，包括5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET和14,15-EET。既往的研究表明，在正常以及病理生理?xiàng)l件下，EETs可以發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗纖維化等。而且，越來越來的證據(jù)表明，EETs能夠減輕器官的缺血再灌注損傷。比如，EETs通過增加局部腦血流和抑制凋亡，減輕CYP2J2轉(zhuǎn)基因小鼠的腦缺血再灌注損傷；通過改善心功能、減少缺血再灌注后

6、心梗面積，保護(hù)心肌組織。此外，用11,12-EET預(yù)處理肺動(dòng)脈可以降低caspase-3的活性。盡管具體機(jī)制不明確，EETs被證實(shí)可以顯著降低缺血再灌注后的離體大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。
　　基于以上結(jié)論,提出這樣的假設(shè)，通過在體內(nèi)過表達(dá)CYP2J2基因，增加內(nèi)源性EETs的表達(dá)，并通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等機(jī)制，減輕肺的缺血再灌注損傷。因此，在本研究中，首先通過轉(zhuǎn)基因在大鼠體內(nèi)過表達(dá)CYP2J2，并成功構(gòu)建大鼠的肺缺血再灌

7、注損傷模型，觀察CYP2J2基因過表達(dá)在大鼠的肺缺血再灌注損傷模型中的作用及其可能的分子機(jī)制，并進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中探討了CYP2J2基因過表達(dá)和外源性EETs預(yù)處理對缺氧復(fù)氧模型中肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用及可能的信號通路，旨在從動(dòng)物整體水平和細(xì)胞水平進(jìn)一步明確肺缺血再灌注損傷的機(jī)制，并闡明CYP2J2-EETs系統(tǒng)在肺的缺血再灌注損傷中的作用及其相關(guān)的信號通路，為肺缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　一、CYP

8、2J2基因過表達(dá)及外源性EETs通過抑制炎癥減輕肺的缺血再灌注損傷
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　?。ㄒ唬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.攜帶目的基因CYP2J2及對照基因GFP的pcDNA3.1-CYP2J2和pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒的提取和純化。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理：
　　50只健康雄性Wistar大鼠，體重280-350g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為：空白對照組(Blank)、單純開胸組(

9、Sham)、肺缺血再灌注損傷組(IR)、肺缺血再灌注+pcDNA3.1-GFP基因轉(zhuǎn)染組(IR+GFP)、肺缺血再灌注+pcDNA3.1-CYP2J2基因轉(zhuǎn)染組(IR+CYP2J2)。術(shù)前2周，按3mg/kg體重，IR+GFP和IR+CYP2J2組的大鼠分別通過尾靜脈注射攜帶相應(yīng)基因的質(zhì)粒，每周1次，連續(xù)2周。其它組大鼠同期通過尾靜脈注射相應(yīng)體積生理鹽水。
　　3.肺缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建：
　　第2次注射1周后，來自IR

10、、IR+GFP、IR+CYP2J2組的大鼠接受經(jīng)第5肋間的左前外側(cè)開胸手術(shù)。首先，按100IU/kg體重，向右心室注射肝素鈉預(yù)防血栓形成。5分鐘后，分離左肺門并用無創(chuàng)性動(dòng)脈夾阻斷，包括左主支氣管、左肺動(dòng)脈和左肺靜脈，通過阻斷通氣和血流造成左肺完全缺血缺氧。1小時(shí)后，松開動(dòng)脈夾，左肺恢復(fù)通氣和血流灌注2小時(shí)。來自單純開胸組的大鼠同樣接受左前外側(cè)開胸手術(shù)，但不執(zhí)行肺缺血再灌注損傷的操作，觀察3小時(shí)。而空白對照組的大鼠不接受任何手術(shù)。

11、　　整個(gè)手術(shù)操作過程是在全麻和氣管插管、呼吸機(jī)輔助呼吸下完成的。整個(gè)過程中，將動(dòng)物置于溫床并用烤燈保持溫暖，手術(shù)切口用溫的生理鹽水濕紗布覆蓋以防止體液丟失。造模結(jié)束后，處死動(dòng)物，留取肺組織、血液及尿液標(biāo)本。
　　4.用Western blot方法檢測各組大鼠肺組織中CYP2J2的蛋白表達(dá)，ELISA方法檢測各組大鼠血漿和肺組織14,15-DHET濃度。
　　5.檢測左肺濕干重比及肺與體重比。
　　6.檢測支氣管肺泡灌洗

12、液蛋白濃度。
　　7.肉眼觀察缺血再灌注后左肺大體標(biāo)本的變化及鏡下觀察HE染色病理組織學(xué)變化。
　　8.用ELISA法檢測大鼠血漿中IL-1β,IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α,可溶性P-選擇素(soluble P-selectin,sP-selectin)及可溶性E-選擇素(soluble E-selectin,sE-selectin)的水平。
　　9.Western blot方法檢測大鼠肺組織中IκBα,

13、NF-κB p65和PPARγ的蛋白表達(dá)水平。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)
　　10.人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率評估：
　　用含5％胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs)，置于37℃、含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞生長至單層密度約90％時(shí)，傳代至6孔板。當(dāng)6孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到60％時(shí)，用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1-CYP2J2和pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞

14、內(nèi)。48-72小時(shí)后，用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率，用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)CYP2J2蛋白表達(dá)。
　　11.HPAECs的分組及體外缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,HR)模型的構(gòu)建：
　　分組：根據(jù)CYP2J2基因轉(zhuǎn)染或外源性EETs的干預(yù)分別分成7組，前者包括：對照組(Control組)、pcDNA3.1-GFP組(GFP組)、pcDNA3.1-CYP2J2組(CYP2J

15、2組)、缺氧復(fù)氧組(HR組)、缺氧復(fù)氧+pcDNA3.1-GFP組(HR+GFP組)、缺氧復(fù)氧+pcDNA3.1-2J2組(HR+CYP2J2組)、缺氧復(fù)氧+pcDNA3.1-2J2+GW9662組(HR+CYP2J2+GW9662組)；后者包括：對照組(Control組)、溶媒組(DMSO組)、EET組、缺氧復(fù)氧組(HR組)、缺氧復(fù)氧+溶媒組(HR+DMSO組)、缺氧復(fù)氧+EET組(HR+EET組)、缺氧復(fù)氧+EET組+GW9662組

16、(HR+EET+GW9662組)。其中GW9662為PPARγ抑制劑。
　　HR模型的構(gòu)建：當(dāng)6孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)80％后，用 PPARγ抑制劑GW9662(1umol/L)預(yù)處理30分鐘，然后向培養(yǎng)基中加入EET(1umol/L)或DMSO。1小時(shí)后，更換無糖無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，置于缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5％CO2,95％N2,37℃)。8小時(shí)后更換回完全細(xì)胞培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱(5％CO2,95％air)復(fù)氧培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。而對照組細(xì)

17、胞在正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，不進(jìn)行缺氧復(fù)氧培養(yǎng)。而對于CYP2J2轉(zhuǎn)基因組，當(dāng)6孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)60％后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后加入GW9662，其余處理與上述一致。
　　12.ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β,IL-6,IL-10,細(xì)胞間粘附因子-1(intracellular adhesion molecular-1,ICAM-1)和血管內(nèi)皮黏附分子-1(vascular endothelial adhesion mo

18、lecular-1,VCAM-1)的水平。
　　13.Western blot方法檢測HPAEC中IκBα,NF-κB p65和PPARγ的蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測顯示pcDNA3.1質(zhì)粒可有效將pcDNA3.1-CYP2J2轉(zhuǎn)染至人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)60％。
　　2.CYP2J2基因轉(zhuǎn)染顯著提高了肺組織及人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞CYP2J2蛋白表達(dá)水平，和體循

19、環(huán)中內(nèi)源性EET水平。
　　3.CYP2J2基因過表達(dá)對左肺濕干重比及肺體重比的影響：
　　IR+CYP2J2組的左肺濕干重比值明顯低于IR組及IR+GFP組，但三組均明顯高于Blank組和Sham組(p<0.05)。而Blank組與Sham組、IR組與IR+GFP組之間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　IR+CYP2J2組的肺體重比值明顯低于IR組及IR+GFP組，但三組均明顯高于Blank組和Sham組(

20、p<0.05)。而Blank組與Sham組、IR組與IR+GFP組之間比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　4.CYP2J2基因過表達(dá)對支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度的影響：
　　IR+CYP2J2組的左肺支氣管肺泡灌洗液總蛋白濃度顯著低于IR組及IR+GFP組，但三組均顯著高于Blank組和Sham組(p<0.05)。
　　5.CYP2J2過表達(dá)對肺大體外觀及組織病理學(xué)的影響：
　　大鼠左肺組織大體外觀顯示：I

21、R組及IR+GFP組左肺充血、水腫明顯，IR+CYP2J2組與之相比明顯減輕，而Blank組及Sham組左肺外觀基本正常，無明顯充血、水腫。
　　光鏡下，大鼠左肺組織HE染色組織病理學(xué)顯示：Blank組及Sham組左肺組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；IR組及IR+GFP組左肺間質(zhì)及血管周圍明顯水腫，肺間質(zhì)及肺泡腔炎癥細(xì)胞浸潤，肺胞內(nèi)可見纖維素沉積和出血，由于水腫、紅細(xì)胞滲出及纖維素沉積，肺泡間隔明顯增寬，提示肺缺血再灌注損傷造模

22、成功；而CYP2J2基因過表達(dá)顯著減輕了肺水腫和炎癥細(xì)胞浸潤。肺組織損傷評分進(jìn)一步證實(shí)了CYP2J2對于肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　6.CYP2J2基因過表達(dá)對大鼠血漿炎癥介質(zhì)及炎癥相關(guān)蛋白的影響：
　　用ELISA方法檢測了大鼠血漿中IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、sP-selectin及 sE-selectin，結(jié)果顯示：在IR組及IR+GFP組，IL-1β、IL-8、TNF-α、sP-selecti

23、n及sE-selectin的水平顯著高于Blank組及Sham組，而CYP2J2基因轉(zhuǎn)染明顯抑制了肺缺血再灌注損傷后上述促炎因子的升高(p<0.05)；同時(shí)，與IR組及IR+GFP組相比，CYP2J2過表達(dá)顯著促進(jìn)了大鼠血漿中抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)增加，但仍明顯低于Blank組和Sham組(p<0.05)。
　　我們同時(shí)用Western blot方法檢測了大鼠肺組織細(xì)胞漿PPARγ、IκBα和細(xì)胞核NF-κB p65的水平，

24、結(jié)果顯示：與Blank組及Sham組相比，IR組及IR+GFP組大鼠肺組織細(xì)胞漿PPARγ、IκBα水平明顯降低，而CYP2J2過表達(dá)則顯著抑制了肺缺血再灌注損傷后這兩種蛋白表達(dá)水平的下降(p<0.05)；相反，與Blank組及Sham組相比，IR組及IR+GFP組大鼠肺組織細(xì)胞核NF-κB p65的水平明顯升高，而CYP2J2過表達(dá)則顯著抑制了這種變化(p<0.05)。
　　7.CYP2J2基因過表達(dá)及外源性11,12-EET對

25、缺氧復(fù)氧后HPAECs的抗炎效應(yīng)及其機(jī)制：
　　ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與Control、GFP及CYP2J2組相比，HR、HR+GFP組的IL-1β和IL-6水平明顯升高，而CYP2J2基因過表達(dá)顯著抑制其升高水平，GW9662則明顯阻斷了CYP2J2的作用(p<0.05)。相反地，與Control、GFP及CYP2J2組相比，HR、HR+GFP組的IL-10水平顯著降低，CYP2J2過表達(dá)顯著抑制其下降水平，而GW9662明顯阻斷

26、了CYP2J2的作用(p<0.05)。然而，盡管與常氧組相比VCAM-1和 ICAM-1的水平顯著升高，但在各HR組間無明顯差異(p>0.05)。
　　Western blot檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與Control、GFP及CYP2J2組相比，HR、HR+GFP組中細(xì)胞漿PPARγ及IκBα表達(dá)明顯下降，而CYP2J2基因過表達(dá)或外源性11,12-EET顯著抑制其下降水平，GW9662則部分阻斷其保護(hù)作用(p<0.05)。此外，HR、H

27、R+GFP組中細(xì)胞核中NF-κB p65較常氧組顯著升高，而CYP2J2過表達(dá)及11,12-EET顯著抑制其升高水平，這種保護(hù)作用可被GW9662阻斷(p<0.05)。
　　二、CYP2J2基因過表達(dá)及外源性EETs通過抑制氧化應(yīng)激和凋亡減輕肺的缺血再灌注損傷
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　?。ㄒ唬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理：參照第一部分。
　　2.Wistar大鼠肺缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建：參照第一部分。

28、
　　3.肺組織切片TUNEL染色鏡下觀察細(xì)胞凋亡：
　　每組隨機(jī)觀察5張切片，每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野，TUNEL染色陽性者提示細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)，即凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例。
　　4.Western blot法檢測大鼠肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白SOD1,SOD2,catalase,gp91,p47和p67的表達(dá)。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)
　　5.人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs)的培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染：參照第

29、一部分。
　　6.HPAECs缺氧復(fù)氧模型的構(gòu)建：參照第一部分。
　　7.用CCK8法檢測外源性EETs對細(xì)胞增殖的影響：
　　將細(xì)胞傳至96孔板，首先觀察不同缺氧復(fù)氧模型對細(xì)胞增殖的影響，分別為缺氧2小時(shí)復(fù)氧4小時(shí)(H2R4)、缺氧4小時(shí)復(fù)氧8小時(shí)(H4R8)、缺氧8小時(shí)復(fù)氧16小時(shí)(H8R16)，分別于0.5、1、2、4個(gè)小時(shí)分別用紫外分光光度計(jì)測定吸光度進(jìn)行評估；然后在常氧下，分別用8,9-EET、11,12-E

30、ET、14,15-EET干預(yù)HPAECs，于加藥后0.5、1、2、4個(gè)小時(shí)測定吸光度，評估不同EET對常氧培養(yǎng)下細(xì)胞增殖的影響；最后觀察3種EET對缺氧復(fù)氧模型細(xì)胞增殖的影響。
　　8.用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測CYP2J2基因過表達(dá)及外源性EETs對缺氧復(fù)氧培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影響。
　　9.用流式細(xì)胞儀檢測CYP2J2基因過表達(dá)及外源性EETs對缺氧復(fù)氧培養(yǎng)后細(xì)

31、胞線粒體膜電位的影響：
　　JC-1是線粒體膜電位特異性敏感的熒光探針，用于檢測線粒體膜電位。正常狀態(tài)下，線粒體膜電位高，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)形成聚合物(J-aggregates)，發(fā)出橙紅色熒光；當(dāng)細(xì)胞損傷出現(xiàn)早期凋亡時(shí)，線粒體膜電位下降，JC-1形成單體(monomer)并發(fā)出綠色熒光。根據(jù)橙紅色熒光與綠色熒光的比值，可以判斷線粒體膜電位的損傷程度。
　　10.流式細(xì)胞儀檢測CYP2J2基因過表達(dá)及外源性EETs對缺

32、氧復(fù)氧培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡的影響。
　　11.Western blot法檢測細(xì)胞中PI3K,磷酸化Thr308-Akt,Bcl-2,Bcl-xl,Bax,SOD1,SOD2,catalase,p67-phox,gp91-phox,p47-phox,caspase-3的蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.CYP2J2過表達(dá)對缺血再灌注后大鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響：
　　Western blot結(jié)果顯示，與Blank組及Sh

33、am組相比，IR組和IR+GFP的gp91、p47、p67表達(dá)顯著升高，CYP2J2過表達(dá)則明顯抑制其升高水平；相反，IR組和IR+GFP組的SOD1、SOD2和catalase蛋白表達(dá)水平明顯低于Blank組及Sham組，CYP2J2過表達(dá)則顯著抑制其下降水平。
　　2.CYP2J2過表達(dá)對缺血再灌注后大鼠肺組織凋亡的影響：
　　TUNEL染色顯示，與Blank組(0.0184±0.007412)及Sham組(0.023±

34、0.007674)相比，IR組(0.202875±0.05523)和IR+GFP(0.201625±0.037067)組的凋亡指數(shù)顯著增加，而CYP2J2過表達(dá)則顯著抑制了缺血再灌注后凋亡指數(shù)的增加水平(p<0.05)。
　　3.外源性EETs對細(xì)胞增殖的影響：
　　CCK8法檢測結(jié)果顯示，不同的缺氧復(fù)氧模型對細(xì)胞活力有影響，與對照組相比，H8R16模型能引起細(xì)胞活力顯著下降(p<0.05)，而H2R4、H4R8模型無明顯影

35、響(p>0.05)；而在常氧條件下，3種EET對細(xì)胞活力均無明顯影響(p>0.05)；在H8R16條件下，與H8R16組和H8R16+DMSO組相比，加入外源性11,12-EET和14,15-EET能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(p<0.05)，而8,9-EET效果不明顯(p>0.05)。
　　4.外源性EETs及CYP2J2過表達(dá)對缺氧復(fù)氧后細(xì)胞內(nèi)ROS的影響：
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與Control、DMSO及3種EET組相比

36、，HR及HR+DMSO組的ROS水平顯著升高，而8,9-EET、11,12-EET及14,15-EET顯著抑制了缺氧復(fù)氧后 ROS的升高水平，14,15-EEZE(EETs的選擇性抑制劑)則明顯阻斷了EETs的作用(p<0.05)；類似的，與Control、GFP及CYP2J2組相比，HR、HR+GFP組的ROS水平明顯升高，而CYP2J2過表達(dá)顯著抑制缺氧復(fù)氧后ROS的升高水平，14,15-EEZE則阻斷了CYP2J2的保護(hù)作用(p<

37、0.05)。熒光顯微鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)了上述效應(yīng)。
　　5.外源性EETs及CYP2J2過表達(dá)對缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的影響：
　　流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，與Control、DMSO及3種EET組相比，HR及HR+DMSO組的細(xì)胞凋亡比例明顯增加，而8,9-EET、11,12-EET及14,15-EET顯著抑制了缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的升高水平，LY294002(PI3K非特異性抑制劑)及14,15-EEZE則阻斷了EETs的保護(hù)作用(

38、p<0.05)；相似的，與Control、GFP及CYP2J2組相比，HR、HR+GFP組的細(xì)胞凋亡比例明顯升高，而CYP2J2過表達(dá)顯著抑制缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡的升高水平，LY294002及14,15-EEZE則阻斷了CYP2J2的保護(hù)作用(p<0.05)。
　　6.外源性EETs及CYP2J2過表達(dá)對缺氧復(fù)氧后細(xì)胞線粒體膜電位的影響：
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與Control、DMSO及14,15-EET組相比，HR及

39、HR+DMSO組的JC-1聚合物/單體比值顯著降低，而14,15-EET顯著抑制了缺氧復(fù)氧后JC-1聚合物/單體比值的下降，這種保護(hù)作用被LY294002及14,15-EEZE阻斷(p<0.05)；類似的，與Control、GFP及CYP2J2組相比，HR、HR+GFP組的JC-1聚合物/單體比值顯著下降，而CYP2J2過表達(dá)顯著抑制其下降水平，LY294002及14,15-EEZE則明顯阻斷了CYP2J2的作用(p<0.05)。

40、>　　7.外源性14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)對缺氧復(fù)氧后細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：
　　Western blot結(jié)果顯示，14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)顯著抑制了缺氧復(fù)氧后gp91(跨膜蛋白)、p47、p67和NOX4蛋白的升高水平，而LY294002則阻斷了14,15-EET及CYP2J2的作用(p<0.05)；相反，與常氧組相比，缺氧復(fù)氧處理后細(xì)胞SOD1、SOD2及catalase的蛋白表達(dá)水平顯著降

41、低，而14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)顯著抑制其降低水平，這種保護(hù)作用可被LY294002阻斷(p<0.05)。
　　8.外源性14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)對缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：
　　Western blot結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧復(fù)氧后細(xì)胞的Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達(dá)水平顯著降低，而14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)顯著抑制其下降水平，LY294002阻斷了14,15-EET

42、及CYP2J2過表達(dá)的保護(hù)作用(p<0.05)；相反，與常氧組相比，缺氧復(fù)氧后細(xì)胞的Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，而14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)顯著抑制其升高水平，這種作用可被LY294002阻斷(p<0.05)。
　　9.外源性14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)對缺氧復(fù)氧后細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)的影響：
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧復(fù)氧能夠顯著抑制PI3

43、K及PI3K依賴性Akt蛋白的磷酸化，外源性14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)可以顯著改善這種抑制水平，而LY294002可阻斷14,15-EET及CYP2J2過表達(dá)的作用(p<0.05)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行比較，p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.CYP

44、2J2基因可在Wistar大鼠肺組織及HPAECs中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，增加CYP2J2蛋白表達(dá)，并提高血循環(huán)EETs的水平。
　　2.CYP2J2過表達(dá)能顯著減輕肺缺血再灌注導(dǎo)致的肺水腫和炎癥細(xì)胞浸潤。
　　3.CYP2J2過表達(dá)可顯著減輕大鼠肺缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，包括抑制促炎介質(zhì)的釋放、抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。
　　4.CYP2J2過表達(dá)可顯著抑制大鼠肺缺血再灌注后氧化應(yīng)激水平。
　　5.CYP2J2過表達(dá)可顯

45、著改善大鼠肺缺血再灌注后細(xì)胞凋亡。
　　6.CYP2J2過表達(dá)或外源性EETs可顯著改善HPAECs缺氧復(fù)氧后炎癥水平，包括抑制促炎細(xì)胞因子的釋放和NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，其抗炎作用可能是通過PPARγ活化來介導(dǎo)的。
　　7.CYP2J2過表達(dá)及外源性EETs可顯著改善HPAECs缺氧復(fù)氧后氧化應(yīng)激水平，包括抑制ROS的產(chǎn)生、抑制NADPH氧化酶的活性及促進(jìn)抗氧化蛋白的表達(dá)。
　　8.CYP2J2過表達(dá)及外源性EET