氣道上皮高表達(dá)mCLCA3與哮喘小鼠氣道炎癥的關(guān)系.pdf

1、第一部分：
　　 目的：研究哮喘相關(guān)基因mCLCA3 在哮喘小鼠模型中的梯度變化及其與Th1/Th2細(xì)胞因子和趨化因子的關(guān)系，并分析其在哮喘氣道炎癥中的作用。
　　 方法：30 只SPF 級(jí)BALB/C小鼠隨機(jī)分為五組，每組6 只（n=6）：D(致敏而未激發(fā)），E(激發(fā)1天），F(xiàn)(激發(fā)3天），G(激發(fā)5天），H(激發(fā)7天）。通過(guò)RT-PCR和免疫組化分別檢測(cè)肺組織中mCLCA3的mRNA和蛋白表達(dá)水平及蛋白定位。采用肺組

2、織切片的HE染色、肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T 淋巴細(xì)胞比例改變來(lái)評(píng)價(jià)肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。RT-PCR法和流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)因子染色檢測(cè)肺組織IL-4和IFN-γ的mRNA和蛋白表達(dá)。ELISA 檢測(cè)炎癥局部不同趨化因子的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：RT-PCR和免疫組化結(jié)果均表明激發(fā)組較未激發(fā)組mCLCA3表達(dá)增加，并且mCLCA3的表達(dá)量隨激發(fā)次數(shù)增加而增加具有激發(fā)時(shí)間依賴性(p＜0

3、.05)且免疫組化提示mCLCA3 僅僅表達(dá)于哮喘小鼠的氣道上皮。與未激發(fā)組小鼠相比（D組），激發(fā)組的小鼠肺組織和肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)均顯著增加。
　　 隨著激發(fā)次數(shù)的增多，肺組織中Th1和Th2 細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ均有不同程度升高，其中激發(fā)最多組（H組）IL-4 與其余各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而各組IFN-γ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA 結(jié)果顯示隨著激發(fā)次數(shù)的增加小鼠BALFCCL17、CCL22均有增加趨勢(shì)，其

4、中G、H組CCL17，H組CCL22 差異較其余組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；激發(fā)多次的小鼠（F、G、H組）BALF中CCL5 有增加趨勢(shì)，但增加的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析表明：mCLCA3 與BALF中CCL17(r=0.584，p<0.01）、CCL22（r=0.461，p<0.05）均成正相關(guān)；E、F、G組CCL5 與mCLCA3(r=0.736，p<0.01）亦成正相關(guān)。mCLCA3 與BALF中總炎癥細(xì)胞（r=0.393，p<0.05）

5、、嗜酸性粒細(xì)胞（r=0.529，p<0.01）正相關(guān)，與肺組織中CD4 +T細(xì)胞（r=-0.558，p<0.05）負(fù)相關(guān)；mCLCA3 與肺組織淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-4和IFN-γmRNA 水平均無(wú)明顯相關(guān)性。
　　 結(jié)論：哮喘小鼠模型氣道上皮中增加的mCLCA3表達(dá)可能通過(guò)參與氣道上皮細(xì)胞趨化因子的分泌而介導(dǎo)炎癥局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)從而在氣道炎癥的發(fā)展中起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步研究mCLCA3 在肺組織

6、炎癥中的作用提供了新的線索。
　　 第二部分：
　　 目的：構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC315-SPA-mCLCA3 融合基因表達(dá)載體，分析其在氣道上皮細(xì)胞系的靶向表達(dá)。
　　 方法：PCR法從 PGL-SPA和 pCR-BluntII-TOPO 載體中克隆全長(zhǎng)2948bp的SPA-mCLCA3基因序列并將其亞克隆入pDC315-EGFP 載體，構(gòu)建pDC315-SPA-mCLCA3 靶向表達(dá)載體。測(cè)序鑒定正確后分

7、別轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞系（H441）和非氣道上皮細(xì)胞系（293）。每種細(xì)胞分pDC315-EGFP組（對(duì)照組：GFP 陽(yáng)性，mCLCA3 陰性）和 pDC315-SPA-mCLCA3組（mCLCA3 陽(yáng)性組），分析mCLCA3 在不同上皮細(xì)胞的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建含有氣道上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SPA的mCLCA3 重組質(zhì)粒。靶向表達(dá)分析表明mCLCA3 mRNA 在高表達(dá)SPA的氣道上皮細(xì)胞系（H441）中表達(dá)