CathepsinZ和CD97對(duì)胃癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制和臨床研究.pdf

1、目的：本研究希望通過對(duì)CD97和CathepsinZ(CTSZ)對(duì)胃癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制研究，探索CD97和CTSZ在胃癌細(xì)胞侵襲力改變中的作用及作用機(jī)制。同時(shí)通過研究胃癌患者胃癌組織中CTSZ的表達(dá)及臨床意義，探討其在腎癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，并進(jìn)一步了解其在臨床方面的價(jià)值，為胃癌的早期診斷和免疫治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)首先通過PCR及western blot對(duì)不同胃癌細(xì)胞株的CTSZ基因水平及總蛋白

2、進(jìn)行檢測(cè)，隨后分別以pcDNA3.1及pGCsilencer質(zhì)粒作為載體，重組構(gòu)建CTSZ過表達(dá)質(zhì)粒及siRNA CTSZ干擾質(zhì)粒。通過轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞得到CTSZ過表達(dá)克隆和CTSZ RNAi克隆，并通過共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、invasion assay、刮痕試驗(yàn)等觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為造成的影響。此外，進(jìn)一步研究可能的細(xì)胞骨架信號(hào)通路，探討CTSZ和CD97影響胃癌細(xì)胞侵襲性的作用機(jī)制。應(yīng)用免疫組化對(duì)胃癌患者的正常組織、癌旁組織

3、、癌組織進(jìn)行染色，檢測(cè)CTSZ表達(dá)水平。同時(shí)觀察胃癌組織CTSZ表達(dá)水平在胃癌TNM不同分期時(shí)的差異。
　　結(jié)果：①不同胃癌細(xì)胞株的CTSZ基因與總蛋白表達(dá)水平不同;②CTSZ與胃癌細(xì)胞中溶酶體的分布區(qū)域相同;③與未轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CTSZ轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞骨架呈現(xiàn)向四周發(fā)散狀改變，細(xì)胞周期縮短，侵襲性和遷徙能力上升。干擾克隆pGCsilencer-CTSZ轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，遷徙相關(guān)蛋白及周期相關(guān)蛋白表達(dá)水

4、平下降，侵襲性和遷徙能力下降;④轉(zhuǎn)錄因子篩查中發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)錄因子SP1在pcDNA3.1-CD97過表達(dá)組增高，在pcDNA3.1-CD97+JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125組表達(dá)下降;⑤免疫共沉淀(chips)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP1轉(zhuǎn)錄因子作用于CTSZ轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1000bp，和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)到的CD97同樣作用于CTSZ轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1000bp的結(jié)果一致;⑥Western blot分析發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組相比，pGCs

5、ilencer-SP1及pcDNA3.1-SP1轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，CTSZ表達(dá)相應(yīng)的下降和升高。同時(shí)pcDNA3.1-CD97轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，CTSZ表達(dá)升高。 pcDNA3.1-CD97+和pGCsilencer-SP1共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，CTSZ表達(dá)下降。正常組織、癌旁組織和胃癌組織中CTSZ表達(dá)水平相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，CTSZ表達(dá)水平在胃癌的TNM分期組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：CD97在胃癌

6、細(xì)胞中的表達(dá)和腫瘤的侵襲性有著密切的聯(lián)系，這一現(xiàn)象已經(jīng)得到認(rèn)同，但是對(duì)CD97在惡性腫瘤中作用機(jī)制的研究仍然處于起步階段。本研究首次通過CTSZ過表達(dá)克隆及siRNA-CTSZ干擾克隆的構(gòu)建，對(duì)CTSZ在胃癌中的作用做出了初步的探索，發(fā)現(xiàn)CTSZ表達(dá)強(qiáng)度和胃癌細(xì)胞的侵襲及遷徙能力呈正相關(guān)的觀點(diǎn)。雖然部分結(jié)果還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但本研究通過對(duì)CTSZ基因在胃癌細(xì)胞中的初步探討，揭示了CTSZ基因的特點(diǎn)，預(yù)示了CTSZ適合作為胃癌的新