犬瘟熱病毒F、H和N基因的克隆和表達(dá).pdf

1、犬瘟熱病是由犬瘟熱病毒(CDV)感染犬和其他食肉動物的多發(fā)性、致死性傳染病.CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬,為有囊膜的負(fù)鏈線性RNA病毒,基因組長約16kb.該研究旨在獲得CDV的N,F和H蛋白基因,將其克隆后在大腸桿菌中表達(dá),獲得大量易于純化的N,F和H蛋白并對其功能進(jìn)行研究,為研制基因工程疫苗和診斷試劑等打下理論基礎(chǔ).一、CDV N基因保守區(qū)序列(NC)的克隆及表達(dá):從犬瘟熱病毒Onderstepoort株中提取病毒RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄

2、聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲得犬瘟熱病毒全長N基因,然后應(yīng)用2對引物擴增獲得2段CDV編碼N蛋白保守區(qū)基因(NC1和NC2),將此片段克隆到質(zhì)粒pGEM-Teasy測序,測序結(jié)果顯示NC1和NC2與CDV Onderstepoort株DNA和推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為99.7﹪、99.3﹪和100﹪、100﹪,利用谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)載體pGEX-5x-3和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合表達(dá)載體pMAl-C2構(gòu)建了重組表達(dá)

3、載體pGEX-5x-3-NC2和pMAl-C2-NC1,重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后,將其分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)plys中和DH5 α細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),pGEX-5x-3-NC2沒有獲得目的蛋白表達(dá),而pMAl-C2-Nc1成功獲得了目的蛋白表達(dá).二、CDV H基因的克隆及表達(dá)嘗試:應(yīng)用一對引物,經(jīng)RT-PCR擴增獲得CDV全長H基因,將此片段克隆到pGEM-Teasy測序,測序結(jié)果顯示與CDV Onderste

4、poort株DNA同源性為98.8﹪,所編碼的氨基酸同源性為98.2﹪.然后利用6×His標(biāo)記的重組表達(dá)載體pQE-32構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pQE-32-H,重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌M15中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),沒有獲得目的蛋白的表達(dá).三、CDV F基因的克隆和表達(dá):應(yīng)用一對引物,經(jīng)RT-PCR擴增獲得CDV全長F基因,以全長F基因為模板應(yīng)用4對引物,通過重疊PCR(OE-PCR)擴增獲得缺失疏水區(qū)的F基因(dF)