犬瘟熱病毒H基因原核表達及間接ELISA的建立.pdf

1、犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）是犬瘟熱（canine distemper，CD）的病原體。CD是威脅犬類健康的最嚴重傳染病之一，發(fā)病后死亡率極高，且無特異性治療藥物。為此，本試驗針對CDV的N基因，建立了快速診斷RT-PCR方法；同時通過RT-PCR方法擴增CDV部分H基因，通過原核表達、復性，成功表達出CDV H蛋白，并構建了H蛋白間接ELISA方法，證實表達的H蛋白具有免疫原性，具體內容如下：

2、r>　　1．根據GenBank公布的CDV N蛋白基因序列，設計了一對特異性引物，成功擴增出464bp的CDV N基因片段。測序結果表明該序列與GenBank已經發(fā)表CDV基因序列的同源性為94.8％～98.5%。利用本文建立的CDV檢測RT-PCR方法對30例疑似CDV病例檢測顯示：RT-PCR檢測方法的陽性檢出率為90%、膠體金試紙陽性檢出率為86.7%，說明RT-PCR方法檢出率和敏感性更優(yōu)。
　　2．血凝素蛋白是誘導機體產

3、生中和抗體的主要蛋白之一。本文去除H基因高度疏水區(qū)核苷酸設計引物，成功克隆了來自南昌CDV病料中CDV長度為1236nt的H基因片段。將該基因片段插入到載體pET32a中，構建了原核表達質粒pET32a-CDVH，重組蛋白H基因在Rosetta菌中獲得了高效表達。表達產物以包涵體的形式存在，經包涵體洗滌、復性、Ni柱純化、透析濃縮，最終獲得濃度為0.561mg/mL重組H蛋白溶液。小鼠免疫試驗顯示，重組蛋白免疫產生的血清抗體效價在1:1