犬瘟熱病毒的分離、鑒定及單克隆抗體的研制.pdf

1、犬瘟熱(Canine distemper,CD)是犬或者其他易感動(dòng)物感染犬瘟熱病毒(Caninedistemper virus,CDV)所引發(fā)的一種高度傳染性和致病性疾病。目前,在我國(guó)由CDV引起的犬瘟熱廣泛流行,是危害養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。本研究根據(jù)CDV的細(xì)胞培養(yǎng)特性,采用異種病毒特異性血清阻斷法,選用Vero細(xì)胞從犬二聯(lián)弱毒活苗樣品中分離獲得一株犬瘟熱(CDV)弱毒株。病毒在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)后,能夠引起細(xì)胞出現(xiàn)園縮、聚

2、集、拉網(wǎng)、壞死等特征性的病變過(guò)程。病變細(xì)胞經(jīng)RT-PCR鑒定CDV,結(jié)果顯示陽(yáng)性。病毒理化試驗(yàn)表明,56℃30min CDV可被滅活,pH7.0～8.0對(duì)病毒活性沒(méi)有影響,pH4.0以下和pH10.0以上病毒活力大大降低。CDV有囊膜,氯仿處理可讓其失去活性,病毒核酸型試驗(yàn)表明,CDV為RNA病毒,凝集試驗(yàn)顯示,CDV不與雞、豬、綿羊及兔紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)。經(jīng)測(cè)定,該CDV弱毒株的毒價(jià)為10-625/mL TCID50。
　　

3、以CDV Onderstepoort毒株的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)PEG沉淀法純化濃縮后作為免疫原,免疫6～8周齡的BALB/c雌性小鼠。經(jīng)過(guò)3次皮下注射免疫后,再進(jìn)行尾靜脈加強(qiáng)免疫,3d后處死小鼠,取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0做融合。用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法篩選能夠分泌單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)反復(fù)的亞克隆篩選,最后得到5雜交瘤細(xì)胞株,均能夠穩(wěn)定地分泌抗CDV的單克隆抗體。分別命名為:1G5、2D7、386、4C7和4G