犬瘟熱病毒N蛋白體外表達(dá)與診斷技術(shù)應(yīng)用研究.pdf

1、犬瘟熱(Canine distemper CD)系由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒引起犬科、鼬科等多種食肉動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病，分布范圍廣，易感動(dòng)物種類(lèi)多，發(fā)病率和死亡率高。 自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，犬瘟熱一直未停止對(duì)動(dòng)物健康的威脅。截至目前，世界各國(guó)凡是有犬科動(dòng)物生存的地區(qū)都有本病發(fā)生，即使美、英、法、澳大利亞、新西蘭、日本等動(dòng)物衛(wèi)生水平較高的發(fā)達(dá)國(guó)也不例外，我國(guó)自1968年首次在黑龍江一野生動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)犬瘟熱，現(xiàn)

2、已蔓延到吉林、遼寧、江蘇、四川、山東、廣西等二十幾個(gè)省區(qū)。 犬瘟熱的流行與傳播嚴(yán)重地影響了經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖、野生動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物貿(mào)易的健康發(fā)展。隨著CDV對(duì)動(dòng)物流行因素的不斷適應(yīng)，其自然感染宿主范圍在不斷擴(kuò)大，加之CDV變異株的出現(xiàn)，犬瘟熱的發(fā)病率和致死率仍居高不下，流行趨勢(shì)由散發(fā)向群發(fā)發(fā)展，臨床癥狀越來(lái)越復(fù)雜，其危害也越來(lái)越大。特別是國(guó)寶大熊貓等珍稀動(dòng)物及獼猴等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的CDV感染，使CDV的致病地位日益突出。 此外，最新

3、研究證實(shí)CDV在體外可感染人的前體破骨細(xì)胞，在破骨細(xì)胞內(nèi)增殖，表明CDV的自然宿主可能已擴(kuò)展到了人類(lèi)，犬瘟熱可能是犬傳染給人的第二個(gè)病毒性傳染病。 鑒于上述因素，國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)始終將其作為重點(diǎn)關(guān)注的疫病之一，我國(guó)也在CD的診斷、防治等領(lǐng)域進(jìn)行大量的研究。本研究由國(guó)家質(zhì)檢總局資助，在口岸動(dòng)物檢疫特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物重點(diǎn)試驗(yàn)完成，旨在收集關(guān)于CD疫情信息、跟蹤研究進(jìn)展、開(kāi)發(fā)診斷技術(shù)、分析流行趨勢(shì)，為進(jìn)一步研究防治措施、完善標(biāo)準(zhǔn)體

4、系奠定基礎(chǔ)，主要包括以下內(nèi)容： 1.狐源犬瘟熱病毒的分離與鑒定本研究用MDCK細(xì)胞從具有疑似犬瘟熱癥狀的病狐血液中分離到一株病毒，該病毒在MDCK細(xì)胞上生長(zhǎng)良好，并能形成典型而規(guī)律的CPE。經(jīng)電鏡觀(guān)察、理化特性、滴度測(cè)定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、RT-PCR和熒光定量RT-PCR鑒定，證實(shí)分離到的病毒為一株犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株，并命名為CDV-FOX-TA.該病毒的分離與鑒定的成功，為進(jìn)一步開(kāi)展狐貍?cè)翢岬木C合性防制和診斷技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)，

5、具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。 2.根據(jù)Genbank上發(fā)表的犬瘟熱病毒(CDV)N基因核酸序列，設(shè)計(jì)、合成一對(duì)CDV N基因特異性引物，并在上下游引物分別引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ/XhoⅠ，采用RT-PCR擴(kuò)增出狐源CDV泰安分離株(CDV-FOX-TA)的N基因片段，純化擴(kuò)增的N基因后，將其克隆入pMD18-T載體。進(jìn)行測(cè)序分析，證實(shí)CDV-FOX-TA N基因含有1個(gè)ORF，全長(zhǎng)1572bp，共編碼523個(gè)氨基酸，N蛋白含有高

6、度保守Tyr-Pro-Ala-Leu-Gly-Leu-His-Glu-Phe九肽序列，是T細(xì)胞表位，可致敏靶細(xì)胞。CDV-FOX-TA N基因與CDV疫苗株Ondersteport、Convac的N基因的同源性分別為96.0％和95.9％，與CDV野毒株N基因的同源性在98.4％-98.9％之間。對(duì)CDV N基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDV-FOX-TA與CDV強(qiáng)毒株的親緣關(guān)系較為密切。 3.根據(jù)GenBank發(fā)表的犬瘟熱病

7、毒N基因全序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異擴(kuò)增CDV N基因的引物。以山東泰安分離的CDV-FOX-TA株細(xì)胞毒中提取病毒RNA來(lái)制模板，利用RT-PCR擴(kuò)增出了1.6kb的N基因，將其克隆到pIREShyg載體上，構(gòu)建了pIRES-N真核表達(dá)載體。然后通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，用潮霉素篩選得到陽(yáng)性克隆。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)鑒定N基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)， RT-PCR方法則從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)N基因在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)。CHO/

8、CDV-N細(xì)胞株的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步研究犬瘟熱血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。 4.RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出犬瘟熱病毒(CDV)核衣殼(N)蛋白基因的高度保守序列后，將其TA克隆至pMD18-T載體中，再將測(cè)序正確的N基因的目的片段亞克隆到原核表達(dá)載體pET24b中6xHis Tag編碼基因的上游，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2(DE3)株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，N基因融合蛋白獲得了高效表達(dá)。SDS-PAGE分析和Wes

9、tern blot分析的結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量為15 kD，與CDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)，間接ELISA結(jié)果也表明重組表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，能夠有效區(qū)分CDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性與陰性血清，表明大腸桿菌表達(dá)的CDV N蛋白在免疫原性上具有與天然N蛋白一定的相似性，可作為診斷用抗原，為下一步建立檢測(cè)CDV的間接ELISA試劑盒奠定了基礎(chǔ)。 5. 將構(gòu)建好的含重組質(zhì)粒且能正確表達(dá)N蛋白的Rosetta2(DE3)菌株中，在最佳誘導(dǎo)條

10、件下獲得重組N蛋白。隨后用鎳親和層析方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，對(duì)純化效果及純化產(chǎn)物的特異性分別用SDS-PAGE電泳及Western-blot試驗(yàn)檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，以純化的重組N蛋白作為包被抗原，對(duì)各種條件進(jìn)行優(yōu)化(如抗原的包被，作用時(shí)間)，確定了判定標(biāo)準(zhǔn)，建立了檢測(cè)CDV抗體的間接ELISA方法。用此方法檢測(cè)了270份血清樣品，并與法國(guó)Synbiotics公司ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比較，符合率達(dá)92.4％。 6.實(shí)驗(yàn)選擇CD

11、V的M基因保守序列作為引物和探針并對(duì)CDV RT-PCR和Taq Man熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了CDV Taq Man熒光定量RT-PCR檢測(cè)cdv技術(shù)。利用檢測(cè)系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可對(duì)待檢樣品中病毒含量定量，精確度可達(dá)0.01 TCID20/ml，敏感性比常規(guī)的RT-PCR的方法高100倍；對(duì)Rabies virus、CPV、CAV-1和CAV-2進(jìn)行檢測(cè)不產(chǎn)生擴(kuò)增，具有高度特異性。C

12、DV TaqMan熒光定量RT-PCR方法在檢測(cè)CDV整個(gè)過(guò)程中從RNA提取到出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果只需3小時(shí)，檢測(cè)時(shí)間大大縮短。本法既可對(duì)血液、扁桃體等體內(nèi)樣品中檢測(cè)病毒，又可對(duì)尿液、結(jié)膜拭子、糞拭子等體外樣品進(jìn)行檢測(cè)，樣品收集不受限制，微量樣品也可進(jìn)行檢測(cè)，而且本法一次可檢測(cè)多個(gè)樣品，檢測(cè)通量高。應(yīng)用結(jié)果表明，TaqMan熒光定量RT-PCR與RT-PCR和電鏡觀(guān)察的符合率高，具有準(zhǔn)確定量、靈敏度高和特異性強(qiáng)、降低污染以及省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，且提