微囊藻毒素--LR對(duì)α4過表達(dá)的人肝細(xì)胞系HL7702的影響.pdf

1、背景:隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，由人類經(jīng)濟(jì)活動(dòng)產(chǎn)生的水體富營(yíng)養(yǎng)化及其所造成的水華暴發(fā)成為全球關(guān)注的重要環(huán)境問題。水華暴發(fā)時(shí)，大量繁殖的藻類所產(chǎn)生的次生代謝物微囊藻毒素(microcystins，MCs)對(duì)水生生物和人類具有健康威脅。在超過100種的MCs異構(gòu)體中，微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)是最為常見且毒性最強(qiáng)的一種，肝臟是其主要的靶器官。MC-LR可以引發(fā)一系列的肝毒性，包括誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、凋亡、肝出血等。目

2、前認(rèn)為，MC-LR的主要致毒機(jī)理是通過抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)的活性從而產(chǎn)生一系列的細(xì)胞毒性作用。PP2A是細(xì)胞內(nèi)主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，參與了包括細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)調(diào)控在內(nèi)的多種細(xì)胞生命活動(dòng)。α4是PP2A一個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白，它能對(duì)PP2A進(jìn)行多種調(diào)節(jié)，包括調(diào)節(jié)PP2A活性和促進(jìn)PP2A核心酶組裝。α4的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活。α4還對(duì)細(xì)胞骨架具有一定調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期

3、發(fā)現(xiàn)MC-LR能夠在多種細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)，這可能與其抑制PP2A活性有關(guān)。隨后，我們?cè)谌伺吣I293細(xì)胞(HEK293)內(nèi)觀察到低濃度MC-LR引發(fā)了PP2A活性應(yīng)激性上調(diào)，這一現(xiàn)象可能與α4和PP2A/C亞基結(jié)合的改變有關(guān)，暗示α4參與了對(duì)MC-LR細(xì)胞毒性效應(yīng)的調(diào)節(jié)過程。將HEK293細(xì)胞內(nèi)α4蛋白過表達(dá)后，本實(shí)驗(yàn)室最近還觀察到MC-LR對(duì)細(xì)胞骨架的破壞作用消失了，提示在MC-LR毒性效應(yīng)下α4的過表達(dá)提高了HEK293內(nèi)

4、細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，這引發(fā)了我們?nèi)绻谄渌?xì)胞系中過表達(dá)α4是否具有同樣效應(yīng)的思考。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)將探究MC-LR處理α4過表達(dá)的人肝細(xì)胞系7702(HL7702)后產(chǎn)生的各種細(xì)胞效應(yīng)，這有助于更好地闡明MC-LR毒性效應(yīng)下α4，PP2A和細(xì)胞骨架的關(guān)系。
　　方法:利用lipofectamineTM2000將α4表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入HL7702內(nèi)24h后，再分別用不同濃度的MC-LR（0μM，1μM和10μM）處理24h。空

5、載質(zhì)粒作為空載對(duì)照組。應(yīng)用酶活性測(cè)定試劑盒、免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)對(duì)本實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的各種細(xì)胞效應(yīng)和相關(guān)分子變化進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:MC-LR染毒α4過表達(dá)的HL7702后;PP2A活性受到顯著抑制;PP2A亞基蛋白水平和PP2A/C亞基的翻譯后修飾水平受到影響，如PP2A/C亞基表達(dá)上調(diào)，PP2A/C亞基Y307位點(diǎn)磷酸化水平升高，PP2A/C亞基L309位點(diǎn)甲基化水平降低;PP2A/C亞基和α4的結(jié)合以及

6、PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結(jié)合均顯著下降;PP2A活性受到抑制的同時(shí)，p-ERK(T202/Y204)，p-JNK(T183/Y185)和p-P38(T180/Y182)磷酸化水平顯著上升，表明三條MAPK通路同時(shí)被激活;細(xì)胞內(nèi)微絲，微管和中間纖維形態(tài)和分布沒有發(fā)生變化，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而骨架相關(guān)蛋白VASP(S157)和Ezrin(T567)磷酸化水平上調(diào)，VASP(S239)磷酸化水平下調(diào)。
　　結(jié)論:α4過表達(dá)后

7、，MC-LR仍然抑制了HL7702細(xì)胞的PP2A活性，其作用方式可能是改變PP2A/C亞基蛋白水平及其翻譯后修飾水平，改變PP2A/C亞基和α4的結(jié)合以及PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結(jié)合;與未過表達(dá)α4的HL7702細(xì)胞類似，ERK1/2，P38和JNK三條通路依然被激活;α4的過表達(dá)在一定程度上拮抗了MC-LR對(duì)骨架的破壞作用，與骨架相關(guān)蛋白VASP(S157)，VASP(S239)和Ezrin(T567)的磷酸化水平改變有關(guān)