EB病毒核抗原(NA1)IgA抗體和Zta蛋白IgA抗體時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的研制.pdf

1、目的：
　　本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制EB病毒NA1IgA、Zta IgA檢測(cè)試劑，通過(guò)評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo)，并與其他檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的可行性。
　　方法:
　　（一）EB病毒NA1 IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑
　　1.1 EB病毒NA1 IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的工藝優(yōu)化。
　　1.1.1 采用間接法研制EB病毒NA1 IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑

2、。
　　1.1.2 配置NA1IgA陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品:陰性對(duì)照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA檢測(cè)陰性的正常人血清;陽(yáng)性對(duì)照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的血清。
　　1.1.3 銪標(biāo)記抗體與純化:將0.5mg抗人IgA抗體加入50KD的蛋白超濾離心柱中，用標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌，9000r/min離心，每次6min，共6次。純化抗體后，按質(zhì)量

3、比5∶1的比例加入銪標(biāo)記配體，標(biāo)記體系為200μL，將待標(biāo)記抗體與銪標(biāo)記試劑充分混勻后置于搖床25℃震蕩過(guò)夜，次日過(guò)分子篩層析純化，收集洗脫液，1mL/管，逐管測(cè)熒光值，合并高值的洗脫液，并用BCA法檢測(cè)收集的洗脫液的終濃度，最后加入0.1％濃度的BSA作保護(hù)劑，-20℃保存。
　　1.1.4 包被濃度的確定:為確定最佳的NA1抗原的包被濃度，我們選取了0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/m

4、L、3μg/mL、4μg/mL七個(gè)不同的包被濃度梯度。在不同的包被濃度下，觀察所選的陰性樣本、陽(yáng)性樣本及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的熒光值，以熒光值趨于穩(wěn)定為最佳的包被濃度。
　　1.1.5 銪標(biāo)稀釋比的確定:用稀釋液將標(biāo)記抗體分別稀釋成1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000七個(gè)不同的稀釋比。不同的銪標(biāo)記抗體稀釋比下，觀察所選陰性樣本、陽(yáng)性樣本及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的熒光值變化，在本底較低

5、的情況下，取陽(yáng)性樣本和陰性樣本的熒光值比值高，區(qū)別比較大的為最佳稀釋比。
　　1.1.6 反應(yīng)時(shí)間的確定:在其他反應(yīng)條件確定的前提下，我們分別設(shè)定15min、30min、45min、60min、90min、120min六個(gè)反應(yīng)時(shí)間，觀察所選樣本及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照熒光值隨著反應(yīng)時(shí)間增加所發(fā)生的變化，以熒光值趨于平衡的時(shí)間作為體系的最佳反應(yīng)時(shí)間。
　　1.2 EB病毒NA1 IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的分析性能評(píng)價(jià)

6、r>　　1.2.1 精密度實(shí)驗(yàn):重復(fù)測(cè)定三個(gè)不同樣本(S1、S2、S3)的熒光值，得到每個(gè)樣本的均值、標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)。
　　1.2.2 特異性實(shí)驗(yàn):巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性樣本，單純皰疹病毒Ⅰ型陽(yáng)性樣本，單純皰疹病毒Ⅱ型陽(yáng)性樣本，乙型肝炎陽(yáng)性樣本，丙型肝炎陽(yáng)性樣本各十例，以自制試劑檢測(cè)上述血清，觀察其檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)檢測(cè)的交叉反應(yīng)性。
　　1.2.3 抗干擾性分析:陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和

7、膽紅素，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均值。
　　1.3 試劑盒臨床性能評(píng)估
　　1.3.1 參考值的確定:以自制的EB病毒NA1 IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒檢測(cè)420份健康人血清，統(tǒng)計(jì)血清熒光值的分布情況，計(jì)算樣本熒光值與陰性對(duì)照的比值。取涵蓋99％以上正常樣本的界值，初步確定為試劑盒的正常人參考值，再結(jié)合ROC曲線最終確定參考值范圍。
　　1.3.2 與對(duì)照試劑盒ELISA的比較試驗(yàn):用自制試劑盒和對(duì)照試劑盒同時(shí)對(duì)50

8、9份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其陰性符合率和陽(yáng)性符合率進(jìn)行比較。
　?。ǘ┧璨《綵ta IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑
　　2.1 EB病毒Zta IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的工藝優(yōu)化。
　　2.1.1 采用間接法研制EB病毒Zta IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑。
　　2.1.2 配置Zta IgA陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品:陰性對(duì)照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA檢測(cè)陰性的正

9、常人血清;陽(yáng)性對(duì)照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的血清。
　　2.1.3 銪標(biāo)記抗體與純化:將0.5mg抗人IgA抗體加入50KD的蛋白超濾離心柱中，用標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌，9000r/min離心，每次6min，共6次。純化抗體后，按質(zhì)量比5∶1的比例加入銪標(biāo)記配體，標(biāo)記體系為200μL，將待標(biāo)記抗體與銪標(biāo)記試劑充分混勻后置于搖床，25℃震蕩過(guò)夜，次日過(guò)分子篩層析純化，收集洗脫液，1mL/管，逐

10、管測(cè)熒光值，合并高值的洗脫液，并用BCA法檢測(cè)收集的洗脫液的終濃度，最后加入1‰濃度的BSA作保護(hù)劑，-20℃保存。
　　2.1.4 包被濃度的確定:為確定最佳的Zta抗原的包被濃度，我們選取了0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、4μg/mL七個(gè)不同的包被濃度梯度。在不同的包被濃度下，觀察所選的陰性樣本、陽(yáng)性樣本及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的熒光值，以熒光值趨于穩(wěn)定時(shí)選其為最佳的

11、包被濃度。
　　2.1.5 銪標(biāo)稀釋比的確定:用稀釋液將標(biāo)記抗體分別稀釋成1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000七個(gè)不同的稀釋比。不同的銪標(biāo)記抗體稀釋比下，觀察所選陰性樣本、陽(yáng)性樣本及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的熒光值變化，在本底較低的前提下，取陽(yáng)性樣本熒光值和陰性樣本熒光值比值高，區(qū)別比較大的為最佳稀釋比。
　　2.1.6 反應(yīng)時(shí)間的確定:在其他反應(yīng)條件確定的前提下，我們分別設(shè)定

12、30min、45min、60min、90min、120min五個(gè)反應(yīng)時(shí)間，觀察所選樣本及陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照熒光值隨著反應(yīng)時(shí)間增加所發(fā)生的變化，以熒光值趨于平衡的時(shí)間作為體系的最佳反應(yīng)時(shí)間。
　　2.2 EB病毒Zta IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的分析性能評(píng)價(jià)
　　2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn):重復(fù)測(cè)定三個(gè)不同樣本(S1、S2、S3)的熒光值，得到每個(gè)樣本的均值、標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)。
　　2.2.2 特

13、異性實(shí)驗(yàn):巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性樣本，單純皰疹病毒Ⅰ型陽(yáng)性樣本，單純皰疹病毒Ⅱ型陽(yáng)性樣本，乙型肝炎陽(yáng)性樣本，丙型肝炎陽(yáng)性樣本各十例，以自制試劑檢測(cè)上述血清，觀察測(cè)定的陰陽(yáng)性情況，評(píng)價(jià)檢測(cè)的交叉反應(yīng)性。
　　2.2.3抗干擾性分析:陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，判斷干擾情況。
　　2.3 試劑盒臨床性能評(píng)估
　　2.3.1 參考值范圍:以自制的EB病毒Zta蛋白IgA時(shí)間分辨熒光免疫分

14、析試劑盒檢測(cè)445份健康人血清，統(tǒng)計(jì)血清熒光值的分布情況，計(jì)算樣本熒光值與陰性對(duì)照的比值。取涵蓋99％正常樣本的界值，初步確定為試劑盒的正常人參考值，再結(jié)合ROC曲線最終確定參考值范圍。
　　2.3.2 與對(duì)照試劑盒的比較:樣本用自制試劑盒和對(duì)照試劑盒同時(shí)對(duì)501份樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其陰性符合率和陽(yáng)性符合率進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬?EB病毒NA1 IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑
　　NA1抗原包被濃度

15、確定為2.5μ g/mL，銪標(biāo)記抗體稀釋比例為1∶2000，反應(yīng)時(shí)間確定為60min。420份健康人血清測(cè)試結(jié)果顯示，當(dāng)樣本熒光值與陰性對(duì)照比值在2.7時(shí)，包含了99％以上的樣本;ROC曲線表明，當(dāng)比值在2.7時(shí)，敏感度為97.7％，特異性為95.5％;據(jù)此設(shè)定本試劑盒的EBNA1 IgA抗體的cutoff值=陰性對(duì)照熒光值×2.7。分析內(nèi)和分析間精密度分別為1.56-4.99％和3.92-6.95％;與CMV、HSVⅠ型、HSVⅡ型、

16、HBV、HCV無(wú)交叉反應(yīng)。干擾性實(shí)驗(yàn)表明自制試劑盒不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。與中山生物公司研制的EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA試劑盒比較，本試劑盒檢測(cè)的結(jié)果與中山生物公司的試劑盒檢測(cè)結(jié)果高度一致，說(shuō)明本試劑能夠滿足臨床檢測(cè)的要求。
　?。ǘ?EB病毒Zta IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑
　　Zta抗原包被濃度確定為2.0μg/mL，銪標(biāo)記抗體稀釋比例為1∶1000，反應(yīng)時(shí)間確定為60min

17、。445份健康人血清測(cè)試結(jié)果顯示，當(dāng)樣本熒光值與陰性對(duì)照比值在3.1時(shí)，包含了99％以上的樣本;ROC曲線表明，當(dāng)比值在3.1時(shí)，敏感度為99.2％，特異性為93.6％;據(jù)此設(shè)定本試劑盒的Zta IgA抗體的cutoff值=陰性對(duì)照熒光值×3.1。分析內(nèi)和分析間精密度分別為2.45％-3.69％和3.80％-4.80％;與巨細(xì)胞病毒，單純皰疹病毒Ⅰ型，單純皰疹病毒Ⅱ型，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒無(wú)交叉反應(yīng)。干擾性實(shí)驗(yàn)表明自制試劑盒不受血

18、紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。與中山生物公司研制的EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA試劑盒比較，對(duì)501份臨床樣本進(jìn)行分析比較，本試劑盒檢測(cè)的結(jié)果與中山生物公司的試劑盒檢測(cè)結(jié)果高度一致，說(shuō)明本試劑能夠滿足臨床檢測(cè)的要求。
　　結(jié)論:
　　以上結(jié)果表明，本研究研制的EB病毒核抗原(NA1) IgA、 Zta IgA時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑的各項(xiàng)指標(biāo)（精密度、特異性、干擾性等）均達(dá)到臨床檢測(cè)試劑要求，有望廣泛應(yīng)用于臨床