抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的制備及IgA抗體抗病毒活性研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。目前臨床上廣泛應(yīng)用疫苗來對(duì)PEDV進(jìn)行防控，但是預(yù)防效果并不佳，PED還是會(huì)時(shí)常發(fā)生，并給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而單克隆抗體在疾病的診斷、治療方面，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，因此本試驗(yàn)應(yīng)用常規(guī)的淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備抗PEDV的單克隆抗體Ig

2、A，旨在研究特異性的IgA抗體對(duì)病毒增殖的影響，將為PED治療藥物的開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　本研究將PEDV細(xì)胞毒經(jīng)超速離心進(jìn)行純化，結(jié)果顯示，純化PEDV的濃度為4.802mg/ml。以純化的PEDV作為包被抗原，通過一系列條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法。優(yōu)化結(jié)果顯示，最佳包被抗原濃度為6.0μg/mL;陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80，37℃作用1h;封閉液為含5％新生牛血清的PBST工作液;酶

3、標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶2000，37℃作用45min;TMB顯色時(shí)間為15min;抗體臨界值為OD450nm≥0.267判定為陽性，OD450nm＜0.267判定為陰性。特異性試驗(yàn)顯示，該方法與TGEV、RV、CSFV、PRRSV、PrV和PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng);重復(fù)性試驗(yàn)顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均值都小于10％。因此，該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，為陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　將純化的PEDV作為

4、抗原，免疫雌性BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)和間接ELISA方法，制備并篩選了7株穩(wěn)定分泌抗PEDV McAb的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3B5、5D10、5C3、1F8、2C7、4E3和2E7。經(jīng)過單克隆抗體亞型的鑒定，5C3、4E3和2E7的抗體亞型均為IgMk;3B5、1F8抗體亞型均為IgG1k;5D10和2C7抗體亞型分別為IgG2ak和IgAk。秋水仙素法分析染色體數(shù)量，結(jié)果顯示，7株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)量在95～103之間。

5、IFA鑒定結(jié)果顯示，7株McAb均能夠與Vero細(xì)胞上增殖的PEDV特異性結(jié)合。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，7株雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清抗體效價(jià)分別為1∶320、1∶160、1∶160、1∶160、1∶80、1∶640、1∶320，相應(yīng)的腹水效價(jià)分別為1∶104、1∶104、1∶103、1∶104、1∶102、1∶106、1∶105。將7株雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代30代，均能穩(wěn)定的分泌抗體。
　　鑒于本試驗(yàn)研究單克隆抗體IgA抗PEDV活性的影

6、響，因此應(yīng)用IgA類單克隆抗體純化試劑盒對(duì)2C7株雜交瘤細(xì)胞制備的相應(yīng)腹水進(jìn)行純化，純化結(jié)果顯示:IgA抗體濃度為3.063mg/ml。體外抗病毒研究采用細(xì)胞中性紅染色法病毒中和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果經(jīng)SPSS軟件分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的OD450nm值存在顯著性差異(P＜0.05)，而且抗體的濃度越高差異越明顯。體內(nèi)抗病毒研究采用初生仔豬的預(yù)防性實(shí)驗(yàn)，通過口服不同劑量的IgA單克隆抗體，24h后給仔豬灌服PEDV細(xì)胞毒，應(yīng)用熒光定量RT-PCR