右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶協(xié)同催化制備低聚右旋糖酐與低聚糖的研究.pdf

1、右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶的協(xié)同催化是一個(gè)涉及生物多糖合成與降解的生化過程,本文采用重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶與真菌來源的右旋糖酐酶雙酶聯(lián)合法對(duì)低聚右旋糖酐與低聚糖的定向制備進(jìn)行研究,通過對(duì)雙酶體系關(guān)鍵影響因素的考察,分析雙酶協(xié)同作用的規(guī)律,建立定向制備分子量可控的低聚右旋糖酐及功能性低聚糖的新型生產(chǎn)工藝,并采用波譜分析技術(shù)對(duì)低聚右旋糖酐的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探索。
　　1.以低聚右旋糖酐的制備為目的,首先運(yùn)用動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定、雙底物催化

2、等實(shí)驗(yàn)挖掘出棘孢青霉右旋糖酐酶優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性,并將高分子的右旋糖酐作為該酶降解的底物,得到分子量為7kDa與5kDa的低聚右旋糖酐,總產(chǎn)率高達(dá)74.3％;然后,將右旋糖酐酶與右旋糖酐蔗糖酶進(jìn)行不同方式的聯(lián)合催化,結(jié)果表明:當(dāng)右旋糖酐酶與右旋糖酐蔗糖酶同時(shí)加入低濃度的蔗糖溶液進(jìn)行催化時(shí),得到的系列右旋糖酐以分子量為5kDa的產(chǎn)品為主體;當(dāng)右旋糖酐酶在右旋糖酐蔗糖酶催化的過程中介入時(shí),得到的系列產(chǎn)品則會(huì)以分子量為20kDa和1

3、0kDa的右旋糖酐為主體;而將右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶協(xié)同作用于系列高濃度的蔗糖溶液,均能得到分子量為5kDa~10kDa的低聚右旋糖酐。運(yùn)用雙酶協(xié)同催化的方法,成功轉(zhuǎn)化蔗糖得到三類分子量的低聚右旋糖酐(20kDa、10kDa、5~8kDa),產(chǎn)品分子量分布均勻,純度良好。
　　2.以低聚糖的制備為目的,首先將右旋糖酐酶與右旋糖酐蔗糖酶構(gòu)成雙酶體系,對(duì)該體系的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行考察,以揭示雙酶協(xié)同催化的規(guī)律,結(jié)果表明:在系列低濃度蔗糖

4、(20~80 mg/mL)的雙酶體系催化過程中,產(chǎn)物的分子量呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢(shì),說明首先進(jìn)行的是右旋糖酐蔗糖酶的合成作用,當(dāng)合成的右旋糖酐到達(dá)一定分子量后右旋糖酐酶才開始發(fā)揮降解作用,右旋糖酐的合成與降解速率在反應(yīng)過程中間會(huì)有一個(gè)平衡時(shí)間段,而后期則以右旋糖酐酶對(duì)右旋糖酐的降解為主;而在系列高濃度蔗糖(200~600 mg/mL)的雙酶體系中,產(chǎn)物分子量呈下降趨勢(shì),并與底物濃度有一定的限制性關(guān)系。然后,對(duì)低聚糖的制備進(jìn)行單酶降解與雙

5、酶合成的比較研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):單酶降解右旋糖酐20得到的產(chǎn)物聚合度主要是 DP2-15,酶解速率與酶的用量成正比,并可以通過調(diào)控避免葡萄糖的生成,與酸解相比具有明顯的優(yōu)勢(shì);雙酶催化蔗糖合成的低聚糖產(chǎn)物的聚合度 DP在2-10之間,富含DP2-DP5的功能性糖分,益生元特性更好。
　　3.首先運(yùn)用紅外光譜、1H–1H COSY及13C–1H HSQC檢測(cè)了低聚右旋糖酐產(chǎn)品的特征官能團(tuán)及分子內(nèi)部 H-H、C-H關(guān)聯(lián)。然后用1H NMR檢

6、測(cè)出雙酶法制備的右旋糖酐20kDa含有96.03%的α-1,6-糖苷鍵和3.97%的α-1,3-糖苷鍵,右旋糖酐6kDa含有96.82%的α-1,6-糖苷鍵和3.18%的α-1,3-糖苷鍵。最后根據(jù)糖苷鍵的含量及分子量推測(cè)出這兩種右旋糖酐的可能結(jié)構(gòu):右旋糖酐20kDa平均每101個(gè)α-1,6-糖苷鍵連接的主鏈即連接有4個(gè)α-1,3-糖苷鍵相連的側(cè)鏈結(jié)構(gòu),而低分子的右旋糖酐6kDa約35個(gè)葡萄糖單元以α-1,6-糖苷鍵相連接,另外有1個(gè)葡