重組右旋糖酐蔗糖表達(dá)條件優(yōu)化及其制備右旋糖酐與果糖的應(yīng)用研究.pdf

1、右旋糖酐蔗糖酶(簡稱DSR,EC2.4.1.5)是一種由腸膜狀明串珠菌產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,該酶的催化是以蔗糖為底物,將蔗糖分子中的D.葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移形成D-glucosyl-dextransucrase,并釋放出果糖,其結(jié)果生成右旋糖酐和果糖兩種重要物質(zhì)。右旋糖酐是具有很大價(jià)值的精細(xì)化學(xué)藥品,可以作為代用血漿、藥物載體以及葡聚糖凝膠,同時(shí)還可以被應(yīng)用于改良食品工業(yè)上的一些食品,比如牛奶和乳酸飲料。果糖是一種左旋性的六碳糖,進(jìn)入人體后

2、可與腸粘膜上皮細(xì)胞載體蛋白結(jié)合吸收進(jìn)入人體內(nèi),在肝、腎、小腸中與特異性果糖激酶作用參與體內(nèi)代謝。歐、美、日均已將果糖列入藥典,將其作為口服劑或注射劑使用,特別是給糖尿病人進(jìn)行使用。本實(shí)驗(yàn)在已經(jīng)完成重組大腸桿菌高效表達(dá)重組右旋糖酐蔗糖酶優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行以蔗糖為底物,在重組右旋糖酐蔗糖酶的催化下制備右旋糖酐和果糖的應(yīng)用研究。
　　 本研究首先對重組右旋糖酐蔗糖酶高效表達(dá)過程進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化的過程主要是從節(jié)約制酶成本的角度來考慮。

3、將發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨以及酵母浸膏替換為蛋白胨與部分無機(jī)鹽,從而達(dá)到培養(yǎng)基優(yōu)化的目的。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),將胰蛋白胨以及酵母浸膏替換為蛋白胨與硝酸鉀,所得酶活表達(dá)能力達(dá)到143.71U/ml,是相同條件下原培養(yǎng)基的93.23％,滿足實(shí)驗(yàn)中催化所需要的酶活力,可以用來替代原培養(yǎng)基?？紤]到IPTG的成本較高且具有毒性,而單獨(dú)使用乳糖誘導(dǎo)物又無法使酶得到高效表達(dá),本實(shí)驗(yàn)對重組右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)過程中的誘導(dǎo)物進(jìn)行了研究。將IPTG與乳糖進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)重

4、組右旋糖酐蔗糖酶的生成,研究發(fā)現(xiàn),將兩者進(jìn)行聯(lián)合使用,IPTG與乳糖的含量分別為0.095mmol/L與2.5g/L的時(shí)候,所得到的重組右旋糖酐蔗糖酶酶活表達(dá)能力達(dá)到161.76U/ml,滿足實(shí)驗(yàn)中所需要的酶活力。其次考察了酶活力與底物加入量對制備右旋糖酐的影響,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:當(dāng)酶活力大于160U/ml以上時(shí),100ml14％的蔗糖溶液中需要加入的酶液量為1ml;當(dāng)酶活力在125U/ml-160U/ml之間時(shí),100ml14％的蔗糖

5、溶液中需要加入的酶液量為3ml;當(dāng)酶活力在90U/ml-125U/ml之間時(shí),100ml14％的蔗糖溶液中需要加入的酶液量為5ml;當(dāng)酶活力在70U/ml以下時(shí),則對整個(gè)過程有影響,即便加入10ml酶液,效果也不是很理想。酶活力的提高會降低酶液的加入量,有助于在催化制備右旋糖酐過程中節(jié)約酶成本。
　　 最后對催化產(chǎn)物果糖的回收與結(jié)晶過程進(jìn)行了研究。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,果糖在水溶液中的直接結(jié)晶方法并不可取,因?yàn)楣窃谒芤褐械娜芙舛群艽?/p>

6、,很難進(jìn)行結(jié)晶?？紤]將果糖的水體系轉(zhuǎn)換成果糖一無水乙醇體系。將醇沉之后的果糖液進(jìn)行旋蒸,制備成合適濃度的果糖溶液,經(jīng)實(shí)驗(yàn)探索,果糖濃度為230g/L時(shí)為最佳,在該濃度的果糖溶液中加入氧化鈣粉末將果糖轉(zhuǎn)化為果糖鈣固體,氧化鈣的加入量是通過果糖15055176838與氧化鈣反應(yīng)的方程式確定的,含果糖量230g/L的溶液中加入的氧化鈣的量為96g/L,然后將果糖鈣加入到無水乙醇中,在無水乙醇中通過加入草酸將果糖鈣中的果糖置換出來,成功的將果糖