用于頂頭孢霉菌基因工程改造相關(guān)工具的構(gòu)建.pdf

1、頭孢菌素類藥物（Cephalosporins）是一族β-內(nèi)酰胺類廣譜抗生素，具有抗菌活性強(qiáng)、療效高、毒性低等特點(diǎn)。生產(chǎn)這類抗生素的前體頭孢菌素C（Cephalosporin C，CPC）由頂頭孢霉（Cephalosporium acremonium）發(fā)酵生產(chǎn)。用基因工程改造的方法獲得高產(chǎn)菌種是進(jìn)行菌種改良的有效途徑。 為了方便的進(jìn)行頂頭孢霉菌的基因工程改造，首先必須構(gòu)建適合在頂頭孢霉中進(jìn)行基因組整合的啟動(dòng)子，以及整合質(zhì)粒等工具。

2、本文通過PCR的方法，成功克隆了產(chǎn)黃青霉異青霉素N合成酶（IPNS）啟動(dòng)子pcp Cp（1．16kb）、頂頭孢霉異青霉素N合成酶（IPNS）啟動(dòng)子pcpC（452bp），經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證，與NCBI上報(bào)道的序列一致。這些啟動(dòng)子可以被頂頭孢霉的RNA聚合酶識(shí)別，用于啟動(dòng)異源基因在頂頭孢霉中的表達(dá)。 為了制備VHb抗體用于免疫印跡檢測(cè)，需要獲得較高純度的VHb蛋白，構(gòu)建了pET28a-vgb重組質(zhì)粒，并發(fā)現(xiàn)vgb基因的第二個(gè)氨基酸編

3、碼是影響VHb蛋白表達(dá)的決定因素。當(dāng)該位點(diǎn)突變成纈氨酸時(shí)幾乎不表達(dá)VHb蛋白。 為了實(shí)現(xiàn)外源基因的在頂頭孢霉中的表達(dá)，摸索了頂頭孢霉原生質(zhì)體制備和再生的條件。確定了頂頭孢霉傳代培養(yǎng)基；用于制備原生質(zhì)體的培養(yǎng)基為改進(jìn)型蔗糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃，150rpm搖瓶培養(yǎng)；采用含0．6mol·L-1的NaCl溶液作為滲穩(wěn)劑的再生培養(yǎng)基進(jìn)行再生；采用1000unit·mL-1的Lywellzyme酶進(jìn)行酶解，0．6mol·L-1的N