井岡霉素高產(chǎn)菌株的基因工程改造.pdf

1、井岡霉素是我國(guó)自主研發(fā)并實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的第一個(gè)農(nóng)用抗生素，主要由吸水鏈霉菌井岡變種（Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis）產(chǎn)生。它對(duì)防治水稻紋枯病具有特效，在亞洲的水稻產(chǎn)區(qū)需求量巨大。同時(shí)，井岡霉素及其衍生物可作為治療II型糖尿病的藥物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前體，具有很高的經(jīng)濟(jì)附加值。鑒于其市場(chǎng)需求的不斷攀升，利用代謝調(diào)控和基因工程手段來(lái)優(yōu)化井岡霉素高產(chǎn)菌株的發(fā)酵性能，獲得產(chǎn)量

2、進(jìn)一步提高的菌株，是本論文的研究重點(diǎn)。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)井岡霉素野生型菌株5008中存在三套同源的afsA-arpA代謝調(diào)控基因，組合缺失A因子受體基因shbR1和shbR3能明顯上調(diào)valABC的轉(zhuǎn)錄水平，井岡霉素的終產(chǎn)量提高約40％。因此，我們首先通過(guò)缺失高產(chǎn)菌株TL01中shbR1和shbR3基因，促使井岡霉素的發(fā)酵產(chǎn)量分別提升14%和11%，在組合缺失菌株中井岡霉素的終產(chǎn)量由22.5g/L提高到28g/L。
　　商品

3、化的井岡霉素粗品通常包含約70%的A組分，15%的B組分，以及其他類(lèi)似物。與有效成分A組分相比，B組分具有明顯低效的抗病原真菌活性。前期研究推測(cè)ValE與ValJ蛋白可能催化A組分轉(zhuǎn)化成B組分。在缺失valE基因后，突變株只產(chǎn)生少量的B組分；在缺失valJ基因后，突變株中B組分的含量與出發(fā)菌株相比減少了35%。并且不論是缺失valE基因，還是缺失valJ基因，對(duì)井岡霉素A的產(chǎn)量沒(méi)有影響。由此，通過(guò)基因工程改造，我們成功實(shí)現(xiàn)了井岡霉素A組

4、分的特異性積累。
　　井岡霉素工業(yè)發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生大量的色素，48小時(shí)發(fā)酵液呈現(xiàn)深褐色，加大了下游分離純化的難度，并影響了產(chǎn)品的色澤、產(chǎn)率和質(zhì)量。為了消除發(fā)酵液中的色素，我們通過(guò)全基因組分析，在基因組中尋找到了四組可能參與色素合成的基因，分別參與以酪氨酸為前體的黑色素、III型聚酮合酶（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為PKS）編碼的黑色素、II型PKS編碼的孢子色素、來(lái)源于尿黑酸的褐黃素的合成。通過(guò)對(duì)上述基因簇進(jìn)行逐一中斷，和出發(fā)菌株TL01相比，多巴類(lèi)黑

5、色素基因突變株P(guān)Y06中井岡霉素的發(fā)酵產(chǎn)量提高了12%；III型PKS編碼的黑色素基因簇突變株P(guān)Y07產(chǎn)量無(wú)明顯變化；II型PKS編碼的孢子色素基因簇缺失和褐黃素基因缺失，分別導(dǎo)致井岡霉素產(chǎn)量下降11.7%和17.2%。所有突變株中井岡霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平和發(fā)酵液顏色均沒(méi)有明顯變化。
　　基于上述改造過(guò)的高產(chǎn)菌株，我們進(jìn)一步中斷井岡霉素生物合成基因簇，成功構(gòu)建了用于高效表達(dá)氨基環(huán)醇類(lèi)化合物的異源宿主。一方面，我們將包含阿卡波糖天然合

6、成基因簇的整合型質(zhì)粒引入到阿卡波糖基因簇被中斷的原始菌株Actinoplanessp. SE50/110（acb）中，可以檢測(cè)到阿卡波糖合成能力的恢復(fù)。但該基因簇在Streptomyces coelicolorM145和Streptomyceslividans1326中的轉(zhuǎn)錄量極低，檢測(cè)不到阿卡波糖的產(chǎn)生。這暗示可能存在未知的副調(diào)控基因抑制阿卡波糖天然合成基因簇的轉(zhuǎn)錄，或者缺乏激活該基因簇表達(dá)的正調(diào)控基因。另一方面，我們選用井岡霉素基因