滲透劑與人工伴侶耦合作用輔助蘋(píng)果酸脫氫酶復(fù)性研究.pdf

1、蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)是生物體三羧酸循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶，在藥物生產(chǎn)過(guò)程中利用其催化特性可實(shí)現(xiàn)DL-蘋(píng)果酸的拆分，從而得到D-蘋(píng)果酸這種重要的手性碳源，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，MDH多為同源二聚體或四聚體結(jié)構(gòu)，也可以作為研究寡聚蛋白結(jié)構(gòu)和功能的理想模型蛋白質(zhì)。為了開(kāi)發(fā)實(shí)用的蛋白質(zhì)體外復(fù)性技術(shù)，并為實(shí)際生產(chǎn)中寡聚包含體蛋白的復(fù)性提供理論支持，本文選取了基因工程表達(dá)產(chǎn)物--大腸桿菌蘋(píng)果酸脫氫酶(E.

2、coliMDH，eMDH)包含體作為研究對(duì)象，進(jìn)行了如下復(fù)性方法和復(fù)性機(jī)理的研究。 研究表明，有些滲透劑對(duì)某些蛋白質(zhì)的復(fù)性有促進(jìn)作用。因此首先考察了三種滲透劑(蔗糖，海藻糖和甜菜堿)輔助eMDH包含體復(fù)性的情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蔗糖和甜菜堿在合適的濃度下可明顯提高eMDH的復(fù)性水平，在復(fù)性酶的終濃度為0.1mg.ml-1時(shí)，復(fù)性產(chǎn)物的活性從自發(fā)的43U·mg-1分別提高到73U·mg-1和77U·mg-1。但海藻糖的作用則不明顯。通過(guò)

3、對(duì)外源熒光和圓二色的結(jié)果分析認(rèn)為，蔗糖主要是抑制蛋白質(zhì)分子的聚集和錯(cuò)誤折疊，使蛋白質(zhì)正確折疊形成富含α螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)；而甜菜堿則可通過(guò)與變性蛋白質(zhì)外露的疏水區(qū)結(jié)合，有效的防止蛋白質(zhì)分子間的錯(cuò)誤折疊。海藻糖雖然可以抑制蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，使復(fù)性產(chǎn)物中β折疊結(jié)構(gòu)含量顯著升高，但α螺旋含量相對(duì)較少。 在上述研究的基礎(chǔ)上，又將人工伴侶與滲透劑共同加入復(fù)性體系，考察其在輔助eMDH復(fù)性過(guò)程中可能存在的耦合作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人工伴侶作用

4、的剝離階段添加一定濃度的滲透劑可以進(jìn)一步提高人工伴侶對(duì)eMDH的促進(jìn)復(fù)性作用。復(fù)性溫度為4℃、復(fù)性酶的終濃度為0.1mg·ml-1時(shí)，當(dāng)加入0.5mol·L-1甜菜堿和蔗糖時(shí)，可以將人工伴侶輔助復(fù)性的效果從102U·mg-1分別提高到137U·mg-1和133U·mg-1。同時(shí)，蔗糖和甜菜堿的加入可以使人工伴侶實(shí)現(xiàn)最佳作用時(shí)的配比有所降低(如甜菜堿的加入使人工伴侶配比從1:8降低到1:6)，為進(jìn)一步提高人工伴侶用量創(chuàng)造了空間。但海藻糖依