重組華支睪吸蟲胞漿和線粒體蘋果酸脫氫酶功能的研究.pdf

1、目的：華支睪吸蟲(肝吸蟲)流行于我國十多個省(自治區(qū))，治療藥物主要為吡喹酮和阿苯噠唑。大量的實驗數(shù)據(jù)表明，血吸蟲、腸道線蟲、一些絳蟲等已出現(xiàn)了針對吡喹酮或阿苯噠唑的抗性。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)肝吸蟲針對吡喹酮或阿苯噠唑的抗性問題，但提前研究可能的替代性藥物仍有必要。蘋果酸脫氫酶(EC1.1.1.37)屬于NAD依賴的2-羥基羧酸脫氫酶。絕大多數(shù)真核細胞內(nèi)具有兩種蘋果酸脫氫酶：胞漿蘋果酸脫氫酶(cMDH)和線粒體蘋果酸脫氫酶(mMDH)。mM

2、DH為三羧酸循環(huán)的重要組成部分，cMDH和mMDH還與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶一起組成天冬氨酸-蘋果酸穿梭體，參與轉(zhuǎn)移細胞內(nèi)還原性平衡物，另外在糖酵解和糖異生等方面也起重要作用。cMDH和mMDH有可能作為藥物或疫苗的靶標。蘋果酸脫氫酶還可用于檢測生物材料中的CO2、醋酸鹽、乙酰CoA、檸檬酸鹽、谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)移酶、ATP-檸檬酸裂解酶和檸檬酸合成酶等。所以，體外表達并得到純化的蘋果酸脫氫酶，并對其結(jié)構(gòu)和功能進行研究，具有一定的價值。

3、 方法：建立華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫，進行大規(guī)模測序，通過各種生物信息學分析，確定肝吸蟲胞漿和線粒體蘋果酸脫氫酶的cDNA，并以Northernblot鑒定是否為全長基因。構(gòu)建pQE-30胞漿蘋果酸脫氫酶基因和pGEX-4T-1線粒體蘋果酸脫氫酶基因的重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌后，IPTG誘導(dǎo)表達，以BDTALONTM金屬離子親和樹脂和GST融合蛋白親和純化柱分別純化體外表達的重組肝吸蟲胞漿蘋果酸脫氫酶(Cs-cMDH)和線粒體蘋