細粒棘球蚴重組抗原14-3-3和蘋果酸脫氫酶誘導宿主DC-CD4+T細胞免疫應答機制的研究.pdf

1、目的：通過比較不同免疫保護力的細粒棘球蚴重組抗原14-3-3（rEg14-3-3）和線粒體蘋果酸脫氫酶（rEgmMDH）對宿主樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的成熟、DC細胞遞呈并促進CD4+T細胞活化、分化及效應的影響，研究細粒棘球蚴抗原所誘導的宿主免疫應答機制。
　　方法：1.抗原的獲?。孩僦亟M抗原的表達：通過原核表達以及親和層析純化獲得細粒棘球蚴重組抗原rEg14-3-3和rEgmMDH，并復性獲取可溶性蛋白

2、rEgmMDH；②天然粗抗原的制備：外科手術剝離細粒棘球蚴病人的包囊并無菌收集囊液和分離原頭蚴，原頭蚴經(jīng)液氮研磨和超聲破碎獲取可溶性抗原。
　　2.小鼠骨髓來源的DC（BMDC）的制備和培養(yǎng)：無菌分離小鼠骨髓細胞，通過GM-CSF、IL-4定向培養(yǎng)7天，獲取未成熟DC。
　　3.不同抗原刺激BMDC的掃描電鏡及流式細胞術檢測：LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原頭蚴粗抗原和囊液分別刺激未成熟BMDC48小時，掃描電

3、鏡觀察各組BMDC表面形態(tài)特征，流式細胞術檢測各組 BMDC的表面分子（MHCⅡ、CD40、CD80和CD86）和極化因子（IL-12和CCL2）的表達水平。
　　4.混合淋巴細胞反應（MLR）及流式細胞術檢測：無菌分離正常小鼠脾臟單個淋巴細胞，通過磁珠分選分離純化小鼠脾臟初始CD4+T細胞。LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原頭蚴粗抗原和囊液刺激培養(yǎng)的BMDC分別與初始CD4+T細胞按1:5的比例混合培養(yǎng)5天。流式細胞

4、術檢測混合淋巴細胞反應（MLR）后Th1，Th2，Th17和Treg細胞占CD4+T細胞的比例。
　　結果：1.獲得高純度的可溶性重組抗原rEg14-3-3和rEgmMDH，以及無菌的囊液抗原和原頭蚴可溶性抗原。
　　2.①掃描電鏡觀察結果顯示LPS、rEg14-3-3、rEgmMDH、SPA和HF抗原刺激的DC細胞均有部分分化為具有樹突狀突起的DC。②流式細胞術檢測各組抗原刺激BMDC的結果顯示，與PBS相比，相應濃度的L

5、PS、rEg14-3-3、rEgmMDH、原頭蚴可溶性抗原和囊液均能刺激BMDC高表達MHCⅡ類分子和CD40（P＜0.05）。與PBS相比，BMDC在相應濃度的LPS、rEg14-3-3、原頭蚴可溶性抗原刺激后，可高表達CD80和CD86（P＜0.05），而相應濃度的rEgmMDH刺激的BMDC低表達CD80（P＞0.05），相應濃度的囊液刺激的BMDC低表達CD86（P＞0.05）。③比較分析rEg14-3-3組和rEgmMDH組

6、BMDC表面分子的表達水平，經(jīng)抗原rEg14-3-3刺激后的BMDC較高水平表達MHCⅡ類分子、CD80和CD86（P＜0.05）。④相應濃度的LPS和rEgmMDH能刺激DC表達較高水平的極化因子IL-12（P＜0.05），相應濃度的rEg14-3-3和囊液能刺激DC表達較高水平的極化因子CCL2（P＜0.05）。
　　3.流式細胞術分析混合淋巴細胞反應后的CD4+T細胞，結果顯示，①與PBS相比，LPS、rEg14-3-3和r

7、EgmMDH能誘導初始CD4+T細胞分化較高水平的CD3+CD4+IFN-γ+T細胞（P＜0.05），而且比較rEg14-3-3和rEgmMDH組CD3+CD4+IFN-γ+T細胞的分化水平，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；② rEg14-3-3、囊液抗原能誘導初始CD4+T細胞分化較高水平的CD3+CD4+IL-4+T細胞（P＜0.05）；③rEgmMDH能誘導初始CD4+T細胞顯著分化高水平的CD3+CD4+IL-17+T細胞（P＜0

8、.05）；④LPS、rEgmMDH、原頭蚴可溶性抗原能誘導初始CD4+T細胞分化較高水平的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞（P＜0.05）。
　　結論：1.與未獲得免疫保護力的抗原rEgmMDH相比，抗原rEg14-3-3更容易誘導DC成熟。
　　2.體外實驗顯示rEg14-3-3負載DC后優(yōu)勢誘導初始CD4+T細胞活化為高水平的Th1、Th2細胞亞群，rEgmMDH負載 DC后優(yōu)勢誘導初始CD4+T細胞活化為高水